镉胁迫下白杨抗坏血酸和谷胱甘肽循环代谢的.doc

毕业论文 设计 题题 目目 镉胁迫下白杨抗坏血酸和谷胱甘肽循环代谢的 研究 学生姓名学生姓名 学号学号 所所在在院院 系系 生生物物科科学学与与工工程程学学院院 专业班专业班级级 指导教师指导教师 2015 年 5 月 25 日 陕西理工学院毕业论文 设计 镉胁迫下白杨抗坏血酸和谷胱甘肽循环代谢的研究 陕西理工学院 生物科学与工程学院 陕西 汉中 723000 指导教师 摘要摘要 本研究以白杨组培苗为材料 采用土培方法 研究了白杨在 Cd2 胁迫下 不同器官中丙二醛 MDA 过氧化氢 H2O2 含量显著增加 导致膜脂过氧化加剧 白杨能够通过增强超氧化物歧化酶 SOD 过氧化氢酶 CAT 抗坏血酸过氧化物酶 APX 活性 增加总抗坏血酸 AsA 抗坏血酸 AsA 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 AsA DHA 含量来减少膜脂过氧化伤害 但高浓度 较长时间的 Cd2 胁迫也会造成 CAT SOD APX 酶受损 酶活性 降低 导致脱氢抗坏血酸 DHA 还原型谷胱苷肽 GSH 还原型谷胱苷肽 氧化型谷胱苷肽 GSH GSSG 与总谷胱苷 肽 GSH GSSG 含量下降 进一步表明白杨对 Cd2 的耐受性及其解毒机理 以期为其在植物修复技术改良与优化中的 应用提供科学依据 关键词关键词 镉 白杨 抗坏血酸 谷胱甘肽 Metabolism of ascorbate and glutathione cycle in white poplar under Cd2 stress Shaanxi Institute of Hanzhong Shaanxi 723000 Tutor Abstract In this study white poplar was used as the experimental material and soil experiment was conducted under four Cd2 concentrations 10 30 50 and 70 M L 1 for 7 14 21 and 28 d by using non Cd as the control in order to investigate the effects of Cd2 on poplar photosynthesis antioxidantive ability and the relation between Cd2 chelation and ability of Cd2 tolerance in plant The result showed that the contents of MDA and H2O2 among different tissues in white poplar significantly increased which indiated that the lipid peroxidation was aggravated White poplar could reduce the lipid peroxidation by increasing the activities of SOD CAT and APX and total AsA AsA AsA DHA contents While under high concentration Cd2 stress the activities of CAT SOD APX and the contents of DHA GSH GSH GSSG GSH GSSG both decreased gradually GSH and AsA contents in white poplar was decreased with the increased of Cd2 concentration this results indicated an crucial role played by GSH and AsA in Cd2 tolerance and detoxification in white 陕西理工学院毕业论文 设计 poplar Thus our study is dedicated to elucidate the mechanism of Cd2 accumulation and toleance in white poplar and provide evidence for its application in phytoremediation Key words Cadmium white poplar ascorbic acid Glutathione 陕西理工学院毕业论文 设计 目录目录 1 1 引言引言 1 1 1 重金属污染土壤的研究现状 1 1 2 镉对人与植物的毒害效应 1 1 2 1 镉对人体的毒害 1 1 2 2 Cd2 对植物的毒害 1 1 2 2 1Cd2 污染对植物生长发育的影响 1 1 3 重金属在植物体内的转运机制 6 1 3 1 植物对镉的排外和富集 6 1 3 2 Cd2 在植物体内吸收转运 7 1 3 3 螯合作用 8 1 3 4 重金属转运蛋白 10 1 3 5 根系分泌物 11 1 3 6 抗氧化系统的增强 11 1 4 植物对重金属污染土壤的修复 12 1 5 研究目的及创新 12 2 2 实验内容与实验方法实验内容与实验方法 13 2 1 实验内容 13 2 1 1 实验材料 13 2 1 2 试剂与仪器 13 2 2 实验方法 13 陕西理工学院毕业论文 设计 2 2 1 实验处理 13 2 2 2 收获的具体方法和注意事项 13 2 2 3 Cd2 元素的测定 13 2 2 4 生物量测定 13 2 2 5 重要抗氧化酶的活性测定 13 2 2 6 非酶抗氧化物质含量分析 14 2 3 数据分析 14 3 3 实验结果与分析实验结果与分析 14 3 1 生物量的测量 14 3 2 重要抗氧化酶的活性测定 15 3 2 2 CAT 酶活性测定 16 3 2 3 APX 酶活性测定 16 3 3 非酶抗氧化物质含量分析 17 3 3 2 还原型谷胱苷肽 GSH 含量测定 17 3 3 3 过氧化氢 H2O2 超氧自由基 O2 和丙二醛 MDA 含量测 定分析 18 3 4 Cd2 元素的测定 19 3 5 总 RNA 的提取和半定量 RT PCR 20 4 4 结论与讨论结论与讨论 22 参参考考文献文献 23 附录附录 A A 缩略词缩略词 25 陕西理工学院毕业论文 设计 附录附录 B B 英文论文英文论文 26 附录附录 C C 中中文文论论文文 35 陕西理工学院毕业论文 设计 第 0 页共 39 页 1 1 引言引言 1 11 1 重金属污染土壤的研究现状重金属污染土壤的研究现状 近年随着采矿业 工业生产及高强度的农业活动将大量的重金属带入土壤环境 破坏土壤生态 系统 重金属通过植物吸收进人食物链 进而在人体内长期累积 严重危害人们的健康 而植物修 复技术以其操作简便 环境友好 修复成本低廉性和工程处理简易等优点日倍受到人们重视 环境 污染是当今全球面临的一个重要问题 尤其是工业和农业所使用以及排放的化学物质种类 数量逐 渐增加 重金属污染的土壤面积日益扩大 人类赖以生存的自然资源 越来越暴露出不堪重负的迹 象 1 土壤重金属污染主要来源于采矿 冶炼 金属加工 化工 废电池处理 电子 制革和染料 等工业排放的 三废 及汽车尾气排放 农药和化肥的施用等 重金属元素一般是指对生物有显著毒 性的元素 如汞 Hg 镉 Cd 铅 Pb 铬 Cr 锌 Zn 铜 Cu 锰 Mn 镍 Ni 等 通常也把砷 As 铍 Be 锂 Li 硒 Se 铝 Al 等包括在内 据统计 全世界每年平均 排放 Hg 约 1 5 万 t Pb 约 500 万 t Cu 约 340 万 t Ni 约 100 万 t Mn 约 1 500 万 t 2 3 近年的统 计资料表明 我国耕地受污染面积 2667 万 hm2 其中 工业 三废 污染 1000 万 hm2 农药残 留施肥污染 1000 万 hm2 受 Cd As Cr Pb 等重金属污染的耕地面积已近 2000 万 hm2 约 占全国耕地总面积的近 1 5 其中镉污染耕地 1 33 万 hm2 涉及 11 个省 25 个地区 被 Hg 污 染 3 2 万 hm2 涉及 15 个省 21 个地区 每年因重金属污染减产粮食 1000 万 t 被重金属污染 粮食 1200 万 尤其是我国耕地受 Cd 重金属污染最为突出 造成的经济损失至少 200 亿元 农业 部环境监测系统表明 全国污水灌溉区面积约 140 万 hm2 遭受重金属污染的土地面积占污染总面 积的 64 8 其中轻度污染占 46 8 中度污染占 9 7 严重污染占 8 4 在这些污染中 以 Hg 和 Cd 的污染面积最大 也最严重 目前 全球的土壤都存在不同程度的重金属污染 土壤中 的重金属对农作物 农产品及地下水会产生不良影响 并通过食物链危及人类健康 由于镉污染是 一种不可逆的累积过程 同时镉是生物迁移性较强 易被植物吸收累积的重金属 因而污染土壤的 治理变得较为困难 近年来全球很重视土壤污染和修复技术的研究 有关修复重金属污染土壤治理 一直是全球生态恢复研究的难点和热点 4 1 21 2 镉对人与植物的毒害效应镉对人与植物的毒害效应 1 2 11 2 1 镉对人体的毒害镉对人体的毒害 镉 Cadmium 是生物毒性最强的重金属之一 被列为五大毒物 Cd Hg As Cr Pb 之首 近 年来 由于工业 三废 排放 不合理的农业管理措施等 导致土壤 Cd 污染日趋严重 5 Cd2 对人与 动物具有很强的毒性 且移动性强 中毒临界浓度低 具积累效应 被联合国环境规划局和国际劳 动卫生重金属委员会认定的重点环境污染物 被美国毒物管理委员列为第六位危害人体健康的有毒 物质 在 1922 至 1965 年间 在日本由于镉中毒死亡的人数就超过了 100 人 镉在生物圈中对健康 和经济都造成了严重的后果 累积在动物体内 特别是在肾 肝 生殖器官中 的镉最终被人类食用 高浓度的镉累积在人体内会严重损害肾脏 而食物中低浓度镉的摄入也会导致肾功能障碍 镉暴露 也可以导致肺气肿和著名的痛痛病 镉在人体内的生物半衰期长达 10 3 0 年 很难被机体降解和 排泄 且其主要积累于人体的肝 肾 胰腺 甲状腺和骨骼等部位 可引起慢性中毒 造成机体器 官一系列损伤反应 严重时 还可引起细胞癌变和突变 己知人体摄入过量镉会导致蛋白尿 氨基 酸尿和糖尿 影响磷 钙的吸收和代谢 造成骨骼疏松 萎缩 变形 断裂等 增加致癌和致畸机 率 甚至导致死亡 1 2 21 2 2 CdCd2 2 对植物的 对植物的毒害毒害 1 2 2 1Cd1 2 2 1Cd2 2 污染对植物生长发育的影响 污染对植物生长发育的影响 Cd2 是对农田受污染最普遍的重金属之一 对植物而言 Cd2 是非必需元素 土壤中过量的 Cd2 被植物吸收后积累在体内 会对植物产生一系列毒害作用 6 Cd2 可通过与金属敏感性基团 如巯基或组氨酞基作用而使酶失活 引起植物细胞死亡 正常条件下 植物体内镉含量很低 一般 不超过 1 0Mg kg 当 Cd2 进入植物并积累到一定程度 就会影响植物的生长 细胞分裂和结构及 多种代谢活动 造成生物量和品质下降 研究表明 大麦受 Cd2 污染后 会导致其种子萌发率 根 陕西理工学院毕业论文 设计 第 1 页共 39 页 生长率下降 且这种影响会随着 Cd2 污染浓度的增大与污染时间的延长而加剧 当 Cd2 浓度为 0 01 M 时 种子萌发率小于 45 根系生长停止 7 同时 Cd2 毒害引起根的损伤和根尖细胞老化 加速 抑制 RNA 的合成及 RNAase 核糖核酸酶及质子泵的活性 抑制硝酸还原酶的活性 减少 根部对硝酸盐的吸收及向地上部转运 抑制根部 Fe3 还原酶活性 引起 Fe2 亏缺 8 10 然而 一些 植物地上部分 Cd2 含量远低于根系 其叶片等器官对 Cd2 的敏感度要远远高过根系 因此 当 Cd2 通过根系吸收转运到地上部时 其毒害效应也相当严重 研究表明 当植物组织中 Cd2 浓度超 过一定水平后 在形态上主要表现为根 茎生长迟缓和叶片失绿 卷曲 掉落 生物量下降 生理 生化方面多表现为光合作用和蒸腾作用受到抑制 引起氧化胁迫和膜的损伤 从而影响植物的生长 发育 1 2 2 2Cd1 2 2 2Cd2 2 对光合作用的影响 对光合作用的影响 许多研究表明 镉 Cd2 胁迫可抑制植物的光合作用 且抑制的程度与胁迫程度呈正相关 随 Cd2 浓度增加 龙葵幼苗叶片净光合速率均比对照下降 6 01 61 71 气孔导度下降 17 94 55 32 和蒸腾速率 17 68 68 10 Cd2 对光合作用的抑制是通过影响植物细胞内酶活性 干扰呼 吸和光合过程中的电子传递 破坏叶绿体的完整性而实现的 叶绿体是植物进行光合作用的场所 充足的叶绿素和完整的叶绿体是光合作用得以顺利进行的保证 Cd 胁迫会降低植物叶片中叶绿素 的含量和叶绿体的数量 破坏叶绿体结构 产生失绿症 11 变黄或出现黄褐色斑点 叶绿体含量减 少 影响光合作用的正常进行 Cd2 可破坏叶绿体膜系统 在低浓度胁迫下 叶绿体的基粒片层稀 疏 层次减少 分布不均 随着重金属胁迫的浓度增加 基粒片层消失 类囊体出现空泡 基粒垛 叠混乱 在高浓度条件下 膜系统开始崩溃 叶绿体球形皱缩 出现大而多的脂类小球 导致叶绿 体功能遭到破坏 而这种破坏可能是由于 Cd2 沉积在类囊体上 并与膜上蛋白体结合 进而破坏了 叶绿体酶系统和阻碍了叶绿体合成 Cd2 能破坏植物细胞内酶及代谢作用的原有区域性 导致根系 脱氢酶 淀粉酶等呼吸作用 碳水化合物代谢相关酶的活性下降研究发现 Cd2 污染后的番茄的叶 绿素 a 和 b 含量均随 Cd2 浓度增大而减少 a b 值随 Cd2 浓度增大而增大 表明 Cd2 对番茄叶绿素 b 的影响比 a 大 导致叶绿素含量下降的原因是 Cd2 抑制原叶绿素酸酷还原酶的活性 并影响了氨 基 酮戊二酸的合成 前者都是叶绿素生物合成所必须的酶 后者是合成叶绿素的中间体 12 另 外 Cd2 还可通过干扰呼吸和光合中的电子传递 导致能量状态降低 减少矿质营养吸收和抑制生 长 经过 Cd2 胁迫的杨树 其植株的叶绿素含量 光合作用 PS II 原初光化学反应量子效率均显 著降低 Cd2 对光系统 I 和光系统 II 均有影响 但对后者的影响更显著 Cd2 胁迫不但会破坏水分平 衡 降低光合速率 破坏光合器官及色素 抑制 RuBP 梭化酶活性 影响碳固定及叶绿素 Hill 反应 损伤光合系统 I 和 II 增加非光化学碎灭等 1 2 2 31 2 2 3 对细胞渗透调节平衡的影响对细胞渗透调节平衡的影响 在非生物胁迫下 细胞膜作为植物调节和控制细胞内外物质运输和交换的重要结构 是植物细 胞和外界环境进行物质交换和信息交流的界面和屏障 13 在细胞渗透调节 维持细胞正常的生理代 谢方面发挥着重要作用 细胞膜的稳定性是细胞进行正常生理功能的基础 其透性是评价植物对污 染物反应的常用指标之一 在重金属胁迫下 植物叶片细胞质膜的组成遭到破坏 细胞内的离子和 有机物大量外渗 导致植物体内一系列生理生化过程失调 细胞外渗液电导度与污染物浓度成正相 关 细胞外渗液电导度与污染物浓度成正相关 细胞中常见的渗透调节物质主要有可溶性糖 可溶 性蛋白 游离脯氨酸 丙二醛 无机离子等 保持体内细胞与组织的水平衡 稳定生物大分子结构 以提高植物的抗性和对逆境的适应性 14 脯氨酸作为一个重要的渗透调节物质 能够减少重金属对 细胞膜和蛋白质造成的损伤 稳定和保护大分子化合物 在逆境条件下 植物为了防御伤害 维持 正常的生理生化功能 植物体内必然相应地产生一系列的物质代谢变化 促进游离脯氨酸 可溶性 糖 可溶性蛋白和丙二醛含量的积累 15 近年来研究表明 丙二醛是表达细胞膜损伤程度的重要标 志 其可与膜上蛋白质结合 引起蛋白质分子间和分子内的交联 形成不溶性的化合物沉积 干扰 细胞的正常生命活动 16 五种树木 香樟 女贞 海桐 银杏 鹅掌揪 在 Cd2 污染胁迫下 叶 片的游离脯氨酸含量变化呈先上升 后降低再上升趋势 1 2 2 41 2 2 4 CdCd2 2 对植物离子吸收的影响 对植物离子吸收的影响 陕西理工学院毕业论文 设计 第 2 页共 39 页 重金属对植物的毒害机理之一是干扰植物对养分的吸收 导致植物体内营养元素失调 相应地 代谢活动不能正常进行 使植物的生长发育间接地受到影响 Cd2 能抑制植物对 N K Mg Mn 的吸收 而对植物吸收 P S Ca Zn Fe 的影响比较复杂 在 Cd2 的胁迫下 紫茉莉矿质元素 Fe K 和 Mg 含量均明显降低 镉胁迫能显著地降低水稻籽粒中 K P Mg Mn 和 Zn 元素的含量 Cd2 可干扰旱柳对 P 的吸收和运输 Cd 胁迫可使龙葵植株营养元素吸收紊乱 并促进龙葵叶片和 根系对 K 的吸收 Cd2 胁迫强烈抑制烟草营养器官的生长发育 明显减少烟草植株体内的 K P Ca 等大量元素的含量 且含量随 Cd2 胁迫浓度的增高而减少 同时镉胁迫增加 Zn Fe Cu Al 等微量元素的含量 1 2 2 5Cd1 2 2 5Cd2 2 对植物活性氧代谢的影响 对植物活性氧代谢的影响 从图 1 1 表明 植物遭受非生物胁迫均会产生活性氧 ROS reactive oxygen species 包括超氧自由 基 superoxide O2 羟自由基 hydroxyl radicals OH 单线态氧 singlet oxide 1O2 过氧化氢 hydrogen peroxide H2O2 等 17 活性氧的产生与植物抗氧化能力之间的不平衡是重金属产生毒害 的原因之一 Cd2 可能还诱导 NADPH 氧化酶活性的提高 促进 NADPH 氧化 导致 O2 大量生 成和植物体内活性氧清除系统功能失调 活性氧的过量存在会使生物大分子 例如膜脂 蛋白质 核酸等被氧化 从而导致细胞氧化损伤 西瓜叶片中 ROS 主要包括 O2 H2O2等 浓度以及膜脂过 氧化程度 即丙二醛含量 是衡量植物体氧化胁迫程度的重要指标 图 1 1 植物叶绿体抗氧化系统 类囊体抗氧化系统包括 t Cu Zn SOD 其位于类囊体表面 在很多 植物中 t Cu Zn SOD 被替换为 t Fe SOD 类囊体抗坏血酸过氧化物酶 t APX 以及铁氧还蛋白 Fd Fd 直接将单脱氢抗坏血酸 MDHA 还原为抗坏血酸 AsA 基质抗氧化系统由基质 Cu Zn SOD t Cu Zn SOD 基质抗坏血酸过氧化物酶 s APX 单脱氢抗坏血酸还原酶 MDHAR 脱 氢抗坏血酸还原酶 DHAR 以及谷胱甘肽还原酶构成 NAD P H 负责还原 MDHA 而 DHA 则是 由铁氧还蛋白 NADP 还原酶 FNR 光激发产生的 MDHA 也在叶绿体内腔中由紫黄质脱环氧化酶 催化产生或者在抗坏血酸释放出电子到两个光系统中时 PSI 或 PSII MDHA 迅速被转化为 AsA 和 DHA 后者跨过内囊体膜进入叶绿体内腔并随后被还原为抗坏血酸 Fig 1 1 Antioxidant system of plant chloroplasts The thylakoidal antioxidant system includes Cu Zn superoxide dismutase t Cu Zn SOD present on the thylakoidal surfaces in many plant species t Cu Zn SOD is substituted by t Fe SOD thylakoidal ascorbate peroxidase t APX and ferredoxin Fd Fd reduces monodehydroascorbate MDHA directly to ascorbate AsA The stromatic antioxidant system is composed by stromatic Cu Zn superoxide dismutase t Cu Zn SOD stromatic APX s APX 陕西理工学院毕业论文 设计 第 3 页共 39 页 monodehydroascorbate reductase MDHAR dehydroascor bate reductase DHAR and glutathione reductase GR NAD P H is used for the reduction of monodehydroascorbate MDHA whereas dehydroascorbate DHA is photo generated by ferredoxin NADP oxidoreductase FNR MDHA is also produced in chloroplast lumen by vio laxantin de epoxidase or when AsA releases electron to the two photosystems PSI or PSII MDHA is rapidly transformed in AsA and DHA This latter enters the lumen by thylakoidal membranes and is reduced to AsA Cd2 是一种非氧化还原金属 a non redox metal Cd2 可通过结合酶活性中心或蛋白巯基 取代蛋白 反应中心的必需金属 Ca Fe Zn 等 释放自由离子 诱发氧化胁迫 引起膜脂的过氧化 导致膜 的损伤 在高浓度 Cd2 胁迫条件下 抗氧化酶活性明显受到抑制 加剧活性氧的释放 导致植物生 长严重受抑制 18 在 Cd2 胁迫下 大麦功能叶的丙二醛含量急剧增加 并随 Cd2 胁迫时间延长而 加剧 超氧化物歧化酶 SOD 和过氧化物酶 POD 活性降低 Cd 胁迫引起的膜脂过氧化在其 他植物中也都有报道 植物活性氧代谢是一个十分复杂的系统 目前对植物非生物胁迫条件下活性 氧代谢过程的有了较多的研究 目前由于植物活性氧代谢是一个十分复杂的过程 利用其信号转到 途径中 如信号的感受 作用位点等一系列问题仍有待进一步解决 1 2 2 61 2 2 6 Cd2 Cd2 对植物保护系统的影响对植物保护系统的影响 当植物受到逆境胁迫时 细胞内活性氧的产生与清除系统的平衡遭到破坏 自由基产生和积累 超过一定的阀值时 就会发生膜伤害 甚至导致植物死亡 19 尽管逆境可在植体内引起氧化胁迫 但植物本身也具有通过复杂的抗氧化系统来保护自身免受过氧化伤害的机制 这个系统包括酶 如 超氧化物歧化酶 SOD EC 1 15 1 1 过氧化氢酶 CAT EC 1 11 1 6 过氧化物酶 Peroxidase POD EC 1 11 1 7 抗坏血酸过氧化物酶 APX EC 1 11 1 11 和谷胱甘肽还原酶 GR EC 1 6 4 2 单脱氢抗坏血酸还原酶 MDHAR EC 1 6 5 4 脱氢抗坏血酸还原酶 DHAR EC 1 8 5 1 等和非酶抗坏血酸 AsA 谷胱甘肽 GSH 等两个系统 Cd2 可诱导活性氧产生 从而导 致细胞内酶及非酶保护系统的抗氧化反应 并使细胞发生膜脂过氧化 Cd2 能抑制 有时是促进 一 些抗氧化酶的活性 在烟草中 Cd2 促进膜脂过氧化 降低 SOD CAT APX GR 等酶的活性 在玉米中研究表明 随着 Cd 离子浓度的增加和 Cd2 胁迫时间的延长 玉米幼苗 SOD 和 CAT 活性 降低 POD 活性增强 蛋白质含量下降 膜脂过氧化作用加剧 质膜透性增大 幼苗的生长受到 抑制 20 镉胁迫导致大麦细胞膜过氧化产物 MDA 累积 加剧膜脂过氧化 但同时伴随着 SOD POD 和 CAT 活性提高 对 Cd2 毒害产生适应性保护反应 Cd2 胁迫使小麦体内活性氧自由 基清除系统的功能降低 21 造成细胞内 H2O2积累 APX 和 GR 活性下降 内源抗氧化剂 AsA 和 GSH 含量减少 细胞内 MDA 的积累表明 膜脂过氧化发生和膜系统受到损伤 Cd2 进入细胞溶 质后首先引起细胞抗氧化能力瞬时缺失 如引起 AsA GSH 循环两个关键酶 GR 和 APX 的瞬时 失活 启动 H2O2 的积累 从图 1 2 进而诱导抗氧化系统的二次防御作用 孙涛等 2011 陕西理工学院毕业论文 设计 第 4 页共 39 页 图 1 2 叶绿体中电子转移以及抗氧化防御系统示意图 由图可以知道 氧气的光还原产生超氧物质 超氧化物歧化为 H2O2 H2O2还原为水 氧化的 ASCs 还原为 ASC 以及参与反应酶类的微区隔化 电子转移链元件 酪氨酸 P682 反应中心 Pheo pheophytin QA 质体醌 紧密结合到 PS II QB 另外一种松散结合到 PSII 的质体醌 PQ 质体醌 Cyt f 细胞色素 PC 质体蓝素 PS I PS I 初级电子受体 Fd Fp NADP 该图没有展示 ATP 在哪里以及如何生成的 Fig 1 2 Schematic representation of electron transport and antioxidative defense system in chloroplast showing photor eduction of dioxygen to generate superoxide disproportionation of superoxide to H2O2 reduction of H2O2 to water associated reduction of oxidized ASCs to ASC and microcompartmentation of the participating enzymes APX as corbate peroxidase ASC as corbate Cu Zn SOD copper zinc super oxide dismutase DHA dehydroascorbate DHAR dehydroascorbate reductase MDA monodehydroascorbate radical MDAR MDA reductase sAPX stromal APX SF stromal factor for enhanced photoreduction of dioxygen tAPX thylakoid bound APX VDE violaxanthin de epoxidase Electron transport chain components Tyr tyrosine P682 reaction center chlorophyll for PSII Pheo pheophytin QA a plastoquinone molecule tightly bound to PS II QB another plastoquinone molecule loosely bound to PSII PQ plastoquinone Cyt f cytochrome f PC plastocyanin P700 reaction center chlorophyll for PS I X primary electron acceptor of PS I Fd ferredoxin Fp flavoprotein NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate The diagram does not show where and how ATP is made Cd2 胁迫条件下对植物的 S N C 代谢都会受到一定的影响 Cho et al 2010 研究表明 S 代谢与水稻对 Cd2 胁迫反应机制密切相关硫代谢产物如谷胱甘肽 GSH 在植物对镉的解毒过程中起 着关键作用 GSH 是水稻抗 Cd 的重要物质 一方面 GSH 是植物螯合肽合成的前体 后者可以 与 Cd2 及其他重金属结合 而 GSH 在谷胱甘肽硫转移酶的作用下也可与进入细胞内的 Cd2 形成 复合物 维持细胞内离子平衡 另一方面 GSH 可以通过抗坏血酸 谷胱甘肽循环 完成对 Cd2 诱导的活性氧 ROS 的清除作用 图 1 3 因此 过量表达硫代谢途径相关酶基因也可以提高植 物对镉的耐性 22 陕西理工学院毕业论文 设计 第 5 页共 39 页 图 1 3 在金属的植物提取中谷胱甘肽中心角色的广义模型 该模型中 金属的吸收和耐受均是必要的前提条件 这 些前提条件均受到金属内平衡的影响 作为螯合代谢物以及生成 PC 的底物 谷胱甘肽对于金属内平衡是必须的 它也是一种抗氧化物 对于金属诱导产生的氧化胁迫解毒具有重要作用 连同整个抗氧化防御体系 在受到金属胁 迫的植物中 它的行为对于 ROS 施加的氧化胁迫具有重要影响 这些胁迫可能导致损伤或者信号转导 因此 GSH 能够影响到参与环境适应的细胞通路和修复机制 以便应对金属接触引起的植物中氧化胁迫挑战 植物的生长 发育以及生物产量是由这些综合响应的效用决定的 Fig 1 3 Generalized model for a central role of glutathione GSH in metal phytoextraction for which metal uptake and tolerance are essential prerequisites that are both influenced by metal homeostasis As a chelating metabolite and as a substrate for PC formation GSH is essential in metal homeostasis It is also an antioxidant important for detoxification of metal induced oxidative stress Together with the entire antioxidative defence system its action is vital during the reactive oxygen species ROS imposed oxidative challenge in plants under metal stress leading to damage and or signalling In this way GSH is able to influence the cellular pathways involved in acclimation and repair mechanisms to cope with the oxidative challenge induced by metal exposure in plants Plant growth and development and hence biomass production are determined by the effectiveness of these integrated responses 1 31 3 重金属在植物体内的转运机制重金属在植物体内的转运机制 重金属元素以可溶的离子态施入土壤后迅速转化为其他复杂的形态 一方面 植物利用地下部 分泌的特殊有机物 如细胞内的金属硫蛋白 植物螯合肽或一些有机酸 氨基酸等物质 促进土壤 中重金属元素的溶解与地下部的吸收 另一方面利用一些特殊的蛋白 如金属硫蛋白 植物螯合肽 等 与重金属离子结合固定 将其吸收的重金属离子累积在根部 从而减轻毒害 23 低浓度的重金 属 Cu Zn Mi 胁迫可促进植物对营养元素的吸收 从而对植物的生长有一定的促进作用 但 环境中过量的重金属对植物细胞正常生长与发育有毒害作用 然而 自然界中 不同的植物种类对 Cd 的抗性不同 有些植物能在高浓度的 Cd 环境中生长 繁殖并完成生活史 表明在长期的进化过 程中这些植物也相应地产生了对重金属的抗性 植物对重金属的抗性 就是植物能生存于某一特定 的 含量较高的重金属环境中而不会出现生长率下降或死亡等毒害症状 如 芦苇对重金属有很高 的抗性 在其他植物都不能生长的环境中 芦苇能正常生长 甚至还能完成生活史 我国已有利用 芦苇的这一特点处理污水的例子 并取得了很好的效益 1 3 11 3 1 植物对镉的排外和富集植物对镉的排外和富集 木本植物根系发达 具有强烈吸收作用 可以从土壤中吸收 富集 沉淀或去除重金属污染物 植物能产生新的重金属积累器官富集重金属 如 初生根皮层通过形成内周皮而起隔离作用 使重 金属在植株根部细胞壁沉淀而束缚其跨膜吸收 或形成重金属高积累根毛 局部累积重金属 减少 陕西理工学院毕业论文 设计 第 6 页共 39 页 重金属向地上部各器官的转移 从而增强抗性 木本植物生长环境的特殊性 其根际环境 特别是 根际 pH 变化 Eh 状况 根系分泌物 根际微生物效应 金属有机成分的改变等 都可能会影响 到木本植物根系对重金属的吸收和运输 众多研究表明 重金属在亚细胞水平的分布与其对植物体的毒性密切相关 细胞壁固持在植物 对重金属的解毒 耐性方面起着重要作用 植物的细胞质膜是 Cd2 及其它各种离子进入细胞的重要 屏障 对各种离子具有选择性吸收的特性 细胞质膜能够通过限制 Cd2 的跨膜运输来阻止 Cd2 进 入细胞内 这在理论上是植物提高对 Cd2 耐性的最好机制 另外 植物对 Cd2 等重金属也具有排 斥性 即重金属被吸收后又被排出体外 这也是植物对重金属的一种很好的解毒方式 不同耐性植 物金属离子吸收与代谢关系的研究发现 植物原生质膜有主动排出金属离子的作用 24 植物还可以 通过老叶的脱落把重金属离子排出体外 植物还可通过将重金属离子分布在一些非活性的或耐性较 高的部分 提高自身对重金属的耐性 这是植物对 Cd2 等重金属胁迫长期适应的结果 重金属在超 积累植物的叶片中都存在区域化分布 在组织水平上 重金属主要分布在表皮细胞 亚表皮细胞和 表皮毛中 细胞壁是重金属进入植物细胞的第一道屏障 由于细胞壁上的胶质酸 多糖和蛋白质等 能提供大量的配位体和官能团 能通过沉淀 络合 吸附等阻碍重金属进入细胞内 使植物对重金 属表现出耐性 超积累植物的耐性与超富集性是由超积累植物本身的生理机制所控制 超积累植物 吸收 富集重金属与其根部细胞具有与重金属较多的结合位点有关 而耐性则与重金属在植物细胞 中分布的区域化有关 即重金属主要存在于细胞壁和液泡中 使其毒性降低 许多研究认为 一些 耐性植物能在根部积累大量重金属离子 植物根系中 Cd2 的含量可达到植株中 Cd2 总量的 70 以 上 这充分说明了植物根系在提高植物 Cd2 耐性方面的作用 一些植物也可以通过将从根系运输到 地上部的 Cd2 在地上某部位富集的作用 来避免 Cd2 对植株体自身造成伤害 如 Cd 超量富集于芥 菜叶片表皮毛中 使其含量比叶片组织高 43 倍 这样避免了 Cd2 对叶肉细胞的直接伤害 而且由 于这种芥菜生长迅速 生长周期短等特点 叶片可大量富集 Cd2 在净化重金属污染的土壤和水体 方面有很大作用 25 1 3 21 3 2 CdCd2 2 在植物体内吸收转运 在植物体内吸收转运 在逆境条件下 植物吸收重金属的主要器官是根系 它是植物最先感受逆境的器官 植物根系 吸收重金属后 开始向茎 叶 枝器官转移 并分配在不同的器官内 Cd 离子在植物体内的转运 是植物能够富集重金属的一个重要的原因 Cd2 吸收进入根细胞后 能与细胞内的有机和无机化 合物结合形成复合物 一些化合物主要包括谷胱甘肽 草酸 组氨酸以及柠檬酸盐等小分子有机物 质对金属螯合能力较弱 可能更多是与金属离子运输过程相关 图 1 4 表明 Cd2 被吸收进入根细 胞后 首先通过液泡膜上转运蛋白暂时储存于液泡并装载到木质部导管 然后在根压和蒸腾流的作 用下 随导管向上运输 从而促进 Cd2 向地上部转移 柳树树干 Cd2 含量约为 0 6 4 lmg kg 树叶 的 Cd2 含量是 1 7 3m g kg 其年生物量为 2 1 8 7t hm2 对不同性质土壤 Cd2 的去除量是每年 2 6 16 5g hm2 不同植物 同一植物的不同部位对 Cd2 的积累能力不同 张连忠研究表明 果树根中 以梨积累的 Cd2 最高 桃和梅次之 苹果则最低 26 土壤中 Cd2 的水平仍然高于桃树体上任何部 位 是韧皮部的 5 6 倍 叶片的 9 7 倍 果实的 68 倍 叶片中 Cd2 的累积水平低于韧皮部组织 但仍达到果实含量的 7 倍之多 桃树器官中 Cd 积累量大小为根 茎 叶 果实 土壤中 Cd2 浓度为 10mg kg 果皮中 Cd2 积累量最大 27 Cd2 被苹果植株吸收以后 大部分滞留在根内 Cd2 在不同 器官的积累量由高到低为 根系 枝干 新梢 叶片 然而 根系吸收的镉经木质部运输到达地上部 茎叶 转移率取决于以下几个因素 1 根系细胞壁和液泡对镉的吸收 固定作用 2 镉离子 在根皮层细胞中横向运输 3 镉离子从根系的中柱薄壁细胞装载到木质部导管 4 镉离子在 木质部中长途运输 5 镉离子从木质部运输到叶细胞 6 镉离子跨叶细胞叶泡膜运输 陕西理工学院毕业论文 设计 第 7 页共 39 页 图 1 4 镉离子在白杨体内的转移和分布 Fig 1 4 The basic scheme of maintaining Cd ions distribution and transferring in grey poplar 1 3 31 3 3 螯合作用螯合作用 重金属胁迫下 植物体内螯合蛋白主要有金属硫蛋白 Like MT 及植物螯合肽 PC 两大类 能 结合被吸收的重金属 转运至液泡储存 使细胞质中的重金属浓度降低 防止金属敏感酶变性失活 减轻重金属对植物毒害作用 植物螯合肽 Phytochelatins PCs 是一种由半胱氨酸 cysteine Cys 谷氨酸 glutamic acid Glu 和 甘氨酸 Glycine Gly 组成的含巯基螯合多肽 分子量一般为 1 4kD 其基本结构为 Glu Cys n Gly n 2 11 由 1 5 可知 植物鳌合肽在镉解毒和代谢过程中起着关键作用 PCs 通过巯基与金属 离子螯合形成对植物无毒的复合物 可减少细胞内游离的重金属离子 从而减轻重金属对植物的毒 害作用 同时 植物螯合肽 PC 是植物体内存在的 Cd 的天然配体 28 PCs 最早由从经镉离子诱 导的蛇根木 Rauvolfia serpentine 悬浮细胞中提取 它与 MT 最大的差异是非基因产物 而是 GSH 在 PCs 催化下合成的小肽化合物 在 10 多种高等植物中 PCs 能结合所吸收的 90 的镉 根系所吸收的镉至少有 60 是以 PC Cd 复合物形式存在 正常情况下 PCs 在植物体内含量极低 但在重金属诱导下 PCs 含量增加 在 Cd2 胁迫下 编码 PCs 合成酶基因高度表达 显著提高了 白杨树叶的 GSH 含量 大量合成 PCs 并以重金属 PC 螯合物形式大量累积重金属 耐镉植物的 螯合肽 Cd2 PC 含量要比对照高出 10 1 000 倍 陕西理工学院毕业论文 设计 第 8 页共 39 页 图 1 5 参与植物根部 Cd 的吸收 隔离以及转移的代谢过程示意图 图中描绘的是两个根细胞 一个朝向根际 右边 另一个临近水和矿物质转移组织 即木质部 左边 他 们通过胞间连丝以共用质体的形式相连接 显然植物细胞通过 ZIP 家族的 Fe2 Zn2 转运蛋白吸收 Cd2 有可能通过 Ca2 转运蛋白或者离子通道 在细胞质中他们被螯合并且不大可能以游离的水合离子存在 最初的配体可能是 GSH bis glutathione Cd 复合物 GS2 Cd II 以及一些潜在的其他未知分子 X Cd II GS2 Cd II 同组成型表达 酶 PCS 相互作用导致 PC 合成的激活 据推断 PC Cd II 复合物 LMW 复合物 可能是通过一种未知的 ABC 型转 运蛋白运输到液泡中 在液泡中 HMW 复合物形成 其包含有硫化物 HMW 复合物代谢率未知 主要是由于它 们仅仅是瞬间存在 液泡隔离的第二种通路可能是 Cd2 H 逆向通道 在拟南芥中候选蛋白是 CAX2 根细胞中金属 隔离通路的活力可能在决定转移到植物地上部分速率上起到重要的作用 第二个因素就是隔离的金属离子的流动性 和易接近性 第三 跨域根部和内皮层的径向共质体通道的效率有很重要的影响 最后 木质部的装载活力 例如 从木质部薄壁细胞到木质部的流出活力 至少有一小部分的液泡 Cd 结合到 HMW 或者未鉴定的复合物 Z Cd II Z 能够明显的通过蛋白如 AtNramp3 运回到细胞质 共质体转运需要获得可流动的高亲和性的配体 GS2 Cd II X Cd II 木质部的装载依赖于位于周围细胞质膜上的流出泵 其中在拟南芥中这个泵为 AtHMA4 也有人提出 PC Cd II 复合物的流出物 在酸性木质部中 Cd II 的配体还是未知的 根据 X 射线吸收光谱实验 发现它们是氮 或者氧气配体 Fig 1 5 Aschematic representation of processes involved in the uptake sequestration and translocation of Cd in plant roots Depicted are two root cells one is facing the rhizosphere right one is adjacent to the water and minerals translocating tissue the xylem left They are symplastically connected via plasmodesmata Cd2 ions are apparently taken up into plant cells by Fe2 Zn2 transporters of the ZIP family and possibly by Ca2 transporters channels In the cytosol they are chelated and most likely not present as free