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PFGE分型技术原理及标准仪器配置 山东省疾控细菌所2013 11 19 张华宁 PFGE基本原理参数设置实验流程细菌分型原理PFGE需配备的相关仪器PFGE所需耗材清单 通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA分子在电场作用下 在凝胶中的迁移率不同而达到分离的目的 当双链DNA分子超过一定的大小以后 DNA双螺旋的半径超过了凝胶的孔径 在琼脂糖中的电泳速度会达到极限 我们称之为 极限迁移率 此时凝胶不能按照分子大小来筛分DNA 有实验证明 长度超过40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中分离 与常规的直流单向电场凝胶电泳不同 这项技术采用定时改变电场方向的交变电源 每次电流方向改变后可持续1s到5min左右 然后再改变电流方向 反复循环 所以将其称之为脉冲式交变电场 目前PFGE装置有垂直脉冲场 电场翻转 旋转 钳位匀强电场 CHEF 等电泳系统 PFGE方法用来研究细菌的分子流行病学特点 能够对全基因组进行分析 最终分析的DNA超过90 可以从整个基因组的角度考虑菌株间的关系 用稀有位点的限制性内切酶进行酶切可以获得菌种某亚种特有的电泳图谱 是PFGE技术的显著优势 灵敏 分型能力强 电场是不断改变的 有利于DNA的迁移重复性好 分辨率高 结果稳定 易于标准化 金标准 相同的操作框架适用于多种菌 只需选择合适内切酶 优化电泳条件即可 参数设置 脉冲时间电场夹角电场强度电泳温度缓冲液组成琼脂糖类型和浓度 脉冲时间是指电场在某个角度持续的时间 脉冲场电泳的核心参数 通常实验中使用的脉冲时间为一个范围值 如 2 20S 脉冲时间的变换可以是线性的或者是非线性的 与电泳时间作区别 电泳时间通常为20hr左右 其根据是标准菌种H9812的20Kb片段距胶的下缘为1 1 5cm 脉冲时间 脉冲时间 不同脉冲时间对带型的影响 随着脉冲时间上限的缩短大片段DNA的位置越来越靠近上端加样孔 同时小片段也得到了充分的分离 随着电场夹角的减小 两个大片段DNA分离的更好 但同时小片段也在逐渐的压缩 所以为了兼顾不同大小的片段需要选择一个合适的电场角度 使用较小的电场夹角可以分离较大的DNA片段 反之较大的电场夹角用来分离较小的片段 当使用较小的电场夹角时 小片段会变的相对集中 大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场夹角为120 电场强度 A 电场强度以V cm来表示的 B 大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场强度为6V cm C 使用较高的电场强度可以分离较大的DNA片段 反之亦然 电泳温度 通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液的温度控制 B 较高的温度会造成条带弥散 影响分辨率 C 通常使用的缓冲液的温度为12 15 标准化温度定为14 缓冲液类型 缓冲液选择 缓冲液的缓冲能力以及长时间电泳后液体的损耗问题 通常缓冲液包括两种0 5XTBE和1XTAE 其中1XTAE常用于MB级DNA片断的分离 3MB 而0 5XTBE常用于 1MB的片断的分离 0 5XTBE 1 0XTAE 琼脂的种类以及琼脂的浓度 使用的琼脂糖浓度越低 所能分离的DNA片段越大 但琼脂浓度低时其机械强度也低 实验操作难度也难免会加大 使用的琼脂糖应当具备以下的特点 1 机械强度大 利于实验操作2 纯度高 可提高电泳的分辨率3 熔点低 包埋细菌时凝胶的温度不易过高标准化操作中使用SeaKemGold SKG 琼脂糖 方法标准化 实验流程 细菌培养 菌体裂解 胶块洗涤 DNA酶切 加样电泳 结果处理 细菌培养 制备胶块 第一天 第二天 第三天 胶块的制备 用琼脂糖将细菌包埋 避免染色体DNA的机械性损伤 实验流程 细菌的裂解 蛋白酶K水解消化蛋白质 特别是与DNA结合的组蛋白 实验流程 胶块中DNA的酶切 寡切点酶片段少而大片段数目 10 25 30 酶切片段的电泳 实验流程 图像的获取 DNA指纹图谱EtBr或GelRed染色 BioNumerics软件作聚类分析 在使用细菌分型的结果进行暴发研究时是基于以下几个假设的 1 属于一次暴发的分离株来源于同一个祖先2 这些菌株应该具有相同的基因型3 流行病学无关的菌株应该有不同的基因型别 细菌分型原理 菌株分型的目的是为了提供实验室角度的证据 这一证据支持那些分离自一次暴发中分离的流行相关 epidemiologicallyrelated 菌株 同时也是遗传相关的 geneticallyrelated 菌株 从而证明这些菌株是同样的菌株 基因事件与条带变化 获得失去插入缺失 无法区分 分离株有相同的带型 包括条带的数目和位置 这些分离株为同一菌株 高度相关 如果PFGE带型仅有因一次基因事件引起的带型变化 这些菌株就被定义为高度相关菌株 这些仅有两到三个条带变化的情况常见于反复传代以及从同一病人中多次分离的菌株 可能相关 PFGE带型与暴发菌株带型变化有两个独立的基因事件引起的条带变化 通常是4到6个条带的变化 这些分离株可能是遗传上相关的 但是并不是紧密相关的 其流行病学关系也并不紧密 这样的突变常见于分离自较长的时间段 大于等于6个月 或者是大规模延伸暴发的病人中 无关 三个独立的基因事件引起的条带变化 7个或者是以上的条带变化 TENOVER原则 TENOVER原则的聚类方法 首先 检查所有的带型 确定能否发现一个暴发带型或者代表带型 如果没有发现代表带型 那么这些分离株很可能是流行病学无关菌株 流行相关的菌株中没有代表带型的情况是小概率事件 其次 以暴发带型为基础和其他分离株的带型进行比较 应该确定每个带型与暴发带型的关系 带型差异超过50 的分离株可以认为是暴发无关分离株 而那些与暴发带型只有2到3个条带差异的分离株被认为是暴发带型的衍生 聚类分析 菌株分型研究不能代替流行病学研究 要将流行病学资料分析研究应作为基础 两项工作虽分别进行 但是要综合在一起进行分析才能确定是否真正存在着暴发 PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法 然而一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月 分型研究就转化为种群研究 另外一些技术 如MLST 主要用于监测微生物种群随时间变化的特点 管家基因的突变是中性突变 不受环境选择压力的影响 近来 这两种方法经常被结合起来