《质粒提取方法》PPT课件.ppt

质粒三种提取方法的比较 基因工程原理与技术实验部分 质粒 Plasmid 是一种染色体外的稳定遗传因子 大小从1 200kb不等 为双链 闭环的DNA分子 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中 质粒主要发现于细菌 放线菌和真菌细胞中 它具有自主复制和转录能力 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 并表达所携带的遗传信息 在细菌细胞内 共价闭环质粒以超螺旋形式存在 在提取质粒过程中 除了超螺旋DNA外 还会产生其它形式的质粒DNA 如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂 分子就能旋转而消除链的张力 形成松驰型的环状分子 称开环DNA OpencircularDNA 简称ocDNA 如果质粒DNA的两条链在同一处断裂 则形成线状DNA LinearDNA 当提取的质粒DNA电泳时 同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快 实验目的 1 学会小量制备质粒DNA的碱裂解方法 煮沸法 小量一步提取法这三种质粒DNA的提取方法 2 三种方法的比较 能够根据不同的实验目的选择合适的方法 实验原理 碱变性原理 根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离 在pH12 0 12 5这个狭窄的范围内 线性DNA双螺旋结构解开而被变性 尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性 但两条互补链彼此互相盘绕 仍会紧密结合在一起 当加入pH4 8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时 共价闭合环状质粒DNA复性快 而线性的染色体DNA复性缓慢 经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去 闭合环状的质粒DNA 在变性后不会分离 复性快 DNA双链 变性 DNA单链 复性 强碱 中性 染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离 难以复性而形成缠绕的结构 与蛋白质 SDS复合物结合在一起 在离心的时候沉淀下去 变性 煮沸法 将细菌悬浮于含TritonX 100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中 然后加热到100 使其裂解 加热除了破坏细胞壁外 还有助于解开DNA链的碱基配对 并使蛋白质和染色体DNA变性 但是 闭环质粒DNA彼此不会分离 这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构 当温度下降后 闭环DNA的碱基又各自就位 形成超螺旋分子 离心除去变性的染色体核蛋白质 就可从上清中回收质粒DNA 由于细菌染色体DNA比质粒大得多 受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上 并发生变性 同样受机械力质粒DNA会变性 机械力后复性 但质粒DNA的复性要快于细菌染色体DNA 小量一步提取法 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤 1 培养细菌使质粒扩增 2 收集和裂解细胞 3 分离和纯化质粒DNA 材料 设备及试剂 一 材料含卡那酶素的E coliDH5 1 5ml塑料离心管 又称eppendorf管 离心管架 二 设备微量取液器 20 l 200 l 1000 l 台式高速离心机 恒温振荡摇床 高压蒸汽消毒器 灭菌锅 涡旋振荡器 电泳仪 琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等 三 试剂1 LB液体培养基 Luria Bertani 称取蛋白胨 Tryptone 10g 酵母提取物 Yeastextract 5g NaCl10g 溶于800ml去离子水中 用NaOH调pH至7 5 加去离子水至总体积1升 高压下蒸气灭菌20分钟 2 LB固体培养基 液体培养基中每升加12g琼脂粉 高压灭菌 3 氨苄青霉素 Ampicillin Amp 母液 配成50mg ml水溶液 20 保存备用 4 溶菌酶溶液 用10mmol LTris Cl pH8 0 溶液配制成10mg ml 并分装成小份 如1 5ml 保存于 20 每一小份一经使用后便予丢弃 5 3mol lNaAc pH5 2 50ml水中溶解40 81gNaAc 3H2O 用冰醋酸调pH至5 2 加水定容至100ml 分装后高压灭菌 储存于4 冰箱 6 溶液 50mmol L葡萄糖 25mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 溶液 可成批配制 每瓶100ml 高压灭菌15分钟 储存于4 冰箱 7 溶液 0 2mol LNaOH 临用前用5 10mol LNaOH母液稀释 1 SDS 8 溶液 5mol LKAc60ml 冰醋酸11 5ml H2O28 5ml 定容至100ml 并高压灭菌 溶液终浓度为 K 3mol L Ac 5mol L 9 RNA酶A母液 将RNA酶A溶于10mmol LTris Cl pH7 5 15mmol LNaCl中 配成10mg ml的溶液 于100 加热15分钟 使混有的DNA酶失活 冷却后用1 5mleppendorf管分装成小份保存于 20 10 饱和酚 市售酚中含有醌等氧化物 这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联 应在160 用冷凝管进行重蒸 重蒸酚加入0 1 的8 羟基喹啉 作为抗氧化剂 并用等体积的0 5mol LTris Cl pH8 0 和0 1mol LTris Cl pH8 0 缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7 6以上 因为酸性条件下DNA会分配于有机相 11 氯仿 按氯仿 异戊醇 24 1体积比加入异戊醇 氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开 异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫 按体积 体积 1 1混合上述饱和酚与氯仿即得酚 氯仿 1 1 酚和氯仿均有很强的腐蚀性 操作时应戴手套 12 TE缓冲液 10mmo LTris Cl pH8 0 1mmol LEDTA pH8 0 高压灭菌后储存于4 冰箱中 13 STET 0 1mol LNaCl 10mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 5 TritonX 100 14 STE 0 1mol LNaCl 10mmol LTris Cl pH8 0 1mmol LEDTA pH8 0 15 电泳所用试剂 1 TBE缓冲液 5 称取Tris54g 硼酸27 5g 并加入0 5MEDTA pH8 0 20ml 定溶至1000ml 2 上样缓冲液 6 0 25 溴酚蓝 40 w v 蔗糖水溶液 操作步骤 一 细菌的培养和收集将含有质粒菌种接种在LB固体培养基 含50 g mlAmp 中 37 培养12 24小时 用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基 含50 g mlKan 中 37 振荡培养约12小时至对数生长后期 二 质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用 这些方法共同特点是简便 快速 能同时处理大量试样 所得DNA有一定纯度 可满足限制酶切割 电泳分析的需要 一 煮沸法 将振荡过夜培养的细菌1 5ml 于8000r min离心1min 弃上清液 将沉淀回溶于350 LSTET 0 1mol LNaCl 10mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 5 TritonX 100 中 加入25 L溶菌酶 10mg mL 放入沸水中40s 立即于10000r min离心10min 吸出上清移至另一个Eppendolf管中或用已灭菌的牙签小心地将沉淀去除 加入40 L2 5mol LNaAc PH5 2 和420 L冰冻的异丙醇 振荡混匀 室温放置5min 12000g 离心5min 弃上清液 用70 乙醇洗涤两次 然后将离心管倒扣在吸水纸上 使尽量干燥 用20 L无菌水溶解沉淀 于 20 冻存 试验步骤 二 碱裂解法 1 取1 5ml培养液倒入1 5mleppendorf管中 4 下10000rpm离心5min 2 弃上清 将管倒置于卫生纸上数分钟 使液体流尽 3 菌体沉淀重悬浮于150 l溶液 中 需剧烈振荡 室温下放置5 10分钟 4 加入新配制的溶液 300 l 盖紧管口 快速温和颠倒eppendorf管数次 以混匀内容物 千万不要振荡 冰浴5分钟 5 加入227 l预冷的溶液 盖紧管口 并倒置离心管 温和振荡10秒 使沉淀混匀 冰浴中5 10分钟 4 下12000g离心5 10分钟 6 上清液移入干净eppendorf管中 加入等体积的酚 氯仿 1 1 颠倒混匀 4 下12000g离心5分钟 重复一次 7 将水相移入干净eppendorf管中 加入0 6 1倍体积的异丙醇 颠倒混匀静置10分钟 然后12000g离心10分钟 8 弃上清 将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出 加入100ul70 乙醇洗沉淀两次 9 吸除上清液 将管倒置于卫生纸上使液体流尽 室温干燥 10 将沉淀溶于20 50 l无菌水中 储于 20 冰箱中 1 提取过程应尽量保持低温 2 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要 采用酚 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好 要将蛋白尽量除干净需多次抽提 3 沉淀DNA通常使用冰乙醇 在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全 沉淀DNA可用异丙醇 一般使用等体积 无水乙醇 2 2 5倍体积 区别 注意 取0 5ml细菌过夜培养物 置1 5ml的Eppendolf管中加入0 5ml的氯仿 异戊醇 用振荡器最大速度振荡1min 充分