《重组DNA药物》PPT课件.ppt

第七章重组DNA药物 一 重组DNA技术与基因工程的基本定义 重组DNA技术是指将一种生物体 供体 的基因与载体在体外进行拼接重组 然后转入另一种生物体 受体 内 使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 也称为分子克隆技术 因此 供体 受体 载体是重组DNA技术的三大基本元件 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用 包括上游技术和下游技术两大组成部分 上游技术指的是基因重组 克隆和表达的设计与构建 即重组DNA技术 而下游则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程 优点 1 可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽 去除内源性物质的不足之处2 提供足够数量的生理活性物质 以进行生理生化 结构的研究3 利用基因工程技术可发现 挖掘更多内源性生理活性物质4 获得新型化合物 主要基因工程产品的研制 开发 上市时间 产品 人生长激素释放抑制素 SRM 人胰岛素 首次克隆表达时间 国家 用途 首次进入市场时间 国家 地区 1977 日本 治疗巨人症 1978 美国 治疗糖尿病 1982 欧洲 人生长激素 HGH 1979 美国 治疗侏儒症 1985 美国 人 干扰素 IFN 1980 美国 治疗病毒感染症 1985 美国 乙肝疫苗 1983 美国 预防乙型肝炎 1986 欧洲 人白细胞介素 2 1984 日本 治疗肿瘤 1989 欧洲 人促红细胞生成素 治疗贫血 1988 欧洲 人粒细胞集落刺激因子 治疗中性白细胞减少症 1991 美国 人组织纤溶酶原激活剂 t PA 治疗血栓症 1987 美国 DNA重组药物制造的主要步骤 获得目的基因 DNA的体外重组 切与连 载体的选择受体细胞的选择 重组DNA分子转化 转 转化子的筛选与鉴定 选 外源基因的大规模表达和分离纯化 产品的检验和制剂制备 二 基本过程 上游阶段 实验室获得目的基因 酶切和酶连 插入适当载体 转入宿主细胞 复制 目的基因分析确证 表达 筛选合适表达系统等下游阶段 将实验室成果产业化发酵参数确定 新型生物反应器研制 高效分离介质及装置开发 生物传感器设计制造 电子计算机优化控制 产品质量控制 注意 上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想 而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证 这是基因工程产业化的基本原则 1 目的基因的获得 1 鸟枪法 基因文库 基因组DNA提取 限制性内切酶部分水解 与载体连接 转化 扩增与筛选2 逆转录法 cDNA文库 mRNA纯化 cDNA第一合成 第二链合成 cDNA克隆 将重组体导入宿主细胞 cDNA文库鉴定 目的cDNA克隆的分离和鉴定3 合成法4 PCR法 4 PCR法或逆转录PCR RT PCR 典型PCR反应包括 模板变性94 以上 1 2 退火50 55 1 2 延伸72 1 2 在高温聚合酶作用下 以DNA单链为模板 由引物起始从5 3 延伸 PCR用于基因突变 化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般结构时 如链长在60bp 100bp可用化学合成法直接合成DNA 2 基因表达 1 选择宿主细胞原核大肠杆菌 生长快 遗传研究深入 产品多为胞内 包含体 或周质中 不能糖基化修饰 需注意内毒素污染 枯草芽孢杆菌 分泌力强 不形成包含体 不修饰 胞外酶可能会降解产物链霉菌 分泌能力强 不致病 安全 有糖基化能力 优点 易大量生产 成本低 周期短缺点 多为胞内表达 提取困难 易生成包含体 含起始密码Met AUG 有内毒素毒性 真核酵母 研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物 基因组小 仅为大肠杆菌4倍 传代时间短 无毒 有分泌功能和修饰功能 已用于干扰素 乙肝表面抗原等重组DNA药物的生产 丝状真菌 有很强的蛋白质分泌能力 能正确加工 糖基化方式与高等生物相似 有成熟发酵和后处理工艺哺乳动物细胞 类似天然产物 但培养条件苛刻 大肠杆菌与真核细胞表达系统比较 大肠杆菌 发酵包含体复性纯化目的蛋白真核细胞 发酵上清液纯化目的蛋白 大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白在大肠杆菌内形成大量无活性包含体 因无法有效的解决复性问题 在美国每年造成的经济损失就达几十亿美元 包含体电镜图 蛋白质复性概念 将蛋白质从结构不规则 无活性的状态 恢复到有唯一立体结构 有生物活性的状态的过程称为蛋白质复性 2 表达载体要求 a 能独立复制b 有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记c 具有有效运载外源基因的能力 能携带大小不同的外源基因d 容易控制 在细胞内稳定性高 安全可靠 如大肠杆菌的pBV220系统 为温度诱导表达载体 已成功用于IL 2 IL 3 IFN等pET系统 最有潜力的系统 可用乳糖代替IPTG 异丙基硫代 D 半乳糖 产物可达细胞总蛋白20 30 表达量可达总蛋白50 pET载体 3 构建工程菌目的基因与载体DNA的连接重组DNA向宿主细胞内转移筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆影响目的基因表达的因素 三 重组药物的分离纯化 A重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则 针对不用的产物表达形式采取不同的策略 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型 多种分离纯化技术的联合运用 合适分离纯化介质的选择 分离纯化过程的规模化 针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白 通常体积大 浓度低 因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理 采用包涵体型战略表达重组蛋白 应先离心回收包涵体 采用融合型战略表达重组蛋白 一般是胞内可溶性的 拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质 应用低浓度的溶菌酶处理 然有再用渗透压休克法释放重组蛋白 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域 大于8或小于5 的重组蛋白应首选离子交换法进行分离 这样很容易除去几乎所有的杂蛋白 重组蛋白特异性的配体 底物 抗体 糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件 原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内 10 8 10 4mol L 疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的 凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的 径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术 在流量 负荷量等参数方面显示出极大的优越性 多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时 通常需要综合使用多种技术 一般来说 在选择分离纯化方法时应遵循下列原则 应选择不同分离纯化机理的方法联合使用 应首先选择能除去含量最多杂质的方法 应尽量选择高效的分离方法 应将最费时 成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段 合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose 理想的分离纯化介质应具有下列性质 对目标蛋白具有较高的分辨效率 对目标蛋白不会造成变性 化学性能和机械性能稳定 重复性好 价格低廉 分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺 技术 方法在大规模产业化过程未必合适 如 实验室方法在工程上可能难以实现 超声波破细胞壁 实验室方法在大规模生产中可能成本过高 超速离心 因此 在很多情况下 实验室的技术路线不等于生产工艺 四 质量控制 1 原材料质量控制 2 培养过程质量控制3 纯化工艺质量控制4 目标产品质量控制 保证编码DNA序列正确要了解以下特性 A 目的基因来源 克隆过程 序列B 表达载体名称 结构 遗传特性及酶切图谱 抗生素标记等C 宿主名称 来源 传代历史 检定结果及生物学特征D 载体引入宿主方式 及载体再宿主中状态E 插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列F 启动和控制克隆基因表达的方法及水平 种子克隆纯而且稳定 在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象种子批系统工作细胞库 尽量去除污染病毒 核酸 宿主细胞杂蛋白等杂质 并避免在纯化过程带入有害物质纯化每一步应测定纯度 计算提纯倍数 收率等等 1 产品的鉴别氨基酸组成分析 肽图分析 N末端和C末端氨基酸测序 蛋白质二硫键的分析 重组蛋白相对分子量 等电点的测定 2 纯度分析 SDS PAGE CE IEF HPLC3 生物活性测定4 残余杂质检测宿主细胞蛋白含量 宿主细胞DNA 残余抗生素等5 安全性检测无菌实验 热原实验 毒性实验 免疫原性检查 A体内生物学活性测定方法生物学模型生长激素大鼠脑垂体B体外生物学活性测定方法如 MTT法 MTTformazan 蓝紫色 干扰素类蛋白 可用细胞毒抑制试验来测定干扰素的体外活性 琥珀酸脱氢酶 五 重要的重组DNA药物 一 利用重组大肠杆菌生产医用蛋白或多肽代表产品 重组人胰岛素 重组人生长激素 重组人干扰素 重组人白细胞介素 重组人集落刺激因子 重组抗体及其片断等 效率高 产量大周期短 成本低工艺稳定 质量可控缺点是易形成包含体 1 干扰素 IFN 1957年Isaccs等发现病毒干扰现象 即病毒感染的细胞能产生一种因子 作用于其他细胞干扰病毒复制 因而命名为干扰素 根据产生干扰素细胞的来源 理化性质和生物活性等差异 可分为 等3种 其中IFN 为多基因产物 有23种以上的亚型 1986年 FDA批准Roch公司的重组IFN 2a和Schering公司的重组IFN 2b 重组IFN 分别在1990年和1993年上市 我国中国预防医学科学院病毒学研究所侯云德等发现中国人受病毒攻击产生的干扰素主要为IFN 1b型 1992年我国第一个基因工程药物IFN 1b获得国家一类新药证书 2 胰岛素 Insulin Ins 1921年 BantingFG等从胰脏中分离1955年 SangerF测序1965年 我国完成结晶牛胰岛素全合成1979年 RutterW等克隆了胰岛素基因1982年 第一个重组人胰岛素批准上市 胰岛素的结构及生物合成胰岛素原与胰岛素人胰岛素的生产方法产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略 a AB链分别表达法体外折叠成功率低 通常只有10 20 b 人胰岛素原表达法由于C肽的存在 胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象 为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件 使得体外折叠率高达80 以上目前ElyLily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素 其经济效益相当可观 c AB链同时表达法 3 生长激素1944年 李卓浩等从牛垂体中分离出牛生长激素1956年 从人垂体中分离出hGH1969年 hGH序列报道临床上用于垂体性侏儒症 1956 1985年 只能从人尸体垂体中分离纯化 但至1985年 共发现50多例克 雅氏症 5人病亡 研究结果证实由垂体来源的生长激素污染有朊病毒 1985年 垂体来源的被禁用 同年 rhGH上市 1985年 美国FDA批准由大肠杆菌发酵生产的重组人生长激素上市 随后各种途径生产的重组人生长激素迅速充斥市场 1997年 仅美国Genentech和ElyLily两家公司的重组人生长激素年产量已达20kg 年销售额超过3 5亿美元 人生长激素的结构与性质重组人生长激素工程菌的构建 二 利用重组酵母生产医用蛋白 优势 1 最简单的真核生物 基因表达调控机理较清楚 并且遗传操作相对较为简单 2 具有原核无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统3 不含有特异性的病毒 不产生毒素 有些酵母菌在食品工业当中有着几百年的应用历史 属于安全型基因工程受体系统 4 大规模发酵工艺简单 成本低廉5 能将外源基因表达产物分泌至培养基中劣势 虽然拥有完整的蛋白质糖基化修饰系统 但其修饰方式不用于高等真核生物 举例 重组乙肝疫苗重组人血清白蛋白 重组HAS的制备 人血清白蛋白HAS是血浆中的主要成分载体蛋白 成熟的人血清白蛋白为一非糖基化的单一多肽链 由585个氨基酸组成 含有17对二硫键 由此维系的空间构象是血清白蛋白的生物功能所必需的 巴斯德毕赤酵母是迄今为止最为优良的重组人血清白蛋白的表达分泌系统 产率可高达15g L 三 利用转基因动物或细胞生产生物大分子 1 利用动物乳腺组织生产蛋白药物酪蛋白 tPA IL 22 利用哺乳动物细胞大规模培养技术生产复杂的人体蛋白例如EPO 促红细胞生成素 EPO 由肾脏分泌的一种唾液酸蛋白 它能促进红细胞系的增值 分化和成熟 由166个氨基酸残基组成的高度糖基化蛋白 其糖基对其生物活性至关重要目前用哺乳动物细胞表达系统如CHO细胞生产 临床为治疗肾衰导致贫血的首选药物 全世界销售额超过10亿美元 1957年Jacobson等证实 肾脏是血清EPO的主要来源 含量极微小 无法分离纯化获得纯品 直到1985年 Jacobs等才先后成功克隆出人 猴 小鼠的EPO基因 随后重组人EPO在CHO细胞中获得表达 并通过层析纯化技术制备出rHuEPO纯品 于1989年获得美国FDA批准后首次投放市场 EPO制备工艺 根据已知天然EPO的氨基酸序列 合成相应的寡聚核苷酸探针 筛选出人EPO基因 引入真核生物质粒表达载体PD11 用磷酸钙微量沉淀法转染CHO细胞 克隆培养后 检测培养上清中EPO的生物学活性 筛选出高效表达EPO的细胞株 按照 中国生物制品规程 要求建立种子库 检定合格后用于生产 CHO工程细胞在条件培养基中培养时 表达的EPO分泌到培养上清中 上清液中除了EPO外 还含有培养基成分和其他杂蛋白 利用EPO本身的物理化学性质 将培养上清液加热至80 或用6mol L盐酸胍 8mol L