《重组DNA技术简介》PPT课件.ppt

资料分析 我们能产人奶 此例子实现了哪种生物的哪些性状在另外哪种生物中表达 性状的表达与我们从前学过的什么过程有关 要实现人的乳蛋白基因在牛中表达 要提前做哪些关键工作 基因工程操作的四个基本步骤 1 提取目的基因2 目的基因与运载体结合3 将目的基因导入受体细胞4 目的基因的检测和表达 基因工程 geneticengineering 所谓基因工程 geneticengineering 就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内 使这个基因能在受体细胞内复制 转录 翻译表达的操作叫基因工程 基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物 1 1DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具 准确切割DNA的工具 分子手术刀 限制性内切酶DNA片段的连接工具 分子缝合针 DNA连接酶基因转移工具 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 限制性内切酶 有何作用 哪里找 限制性核酸内切酶的作用 p4 能识别特定核苷酸序列 从特定部位的两个核苷酸之间切开 是不是把两者的黏性末端黏合起来 这样就真的合成重组的DNA分子了 二 DNA连接酶 分子缝合针 1 种类 2 作用部位 两类 磷酸二酯键 二 DNA连接酶 分子缝合针 DNA连接酶连接黏性末端之间的磷酸二酯键 形成重组的DNA分子 E coliDNA连接酶 连接黏性末端 T4DNA连接酶 连接黏性末端和平末端 DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点 双链 单链 在两DNA片段间形成磷酸二酯键 将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3 末端的羟基上 形成磷酸二酯键 运载体 就是要将目的基因导入到受体细胞中 选择什么作为基因进入受体细胞的载体运载体满足什么条件 作为载体的必要条件 能自我复制有切割位点能与目的基因结合能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达 有遗传标记基因对受体细胞无害 容易分离比较容易得到 3 基因的运输工具 运载体 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在 将来可用含青霉素的培养基鉴别 练习 在基因工程中 切割运载体和含有目的基因的DNA片段 需使用 同种限制酶B 两种限制酶同种连接酶D 两种连接酶基因工程常用的受体细胞有 1 大肠杆菌 2 枯草杆菌 3 支原体 4 动植物细胞A 3 4 B 1 2 4 C 2 3 4 D 1 2 3 不属于质粒被选为基因运载体的理由是A 能复制 B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 练习 3 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的 在基因操作的基本步骤中 不进行碱基互补配对的步骤是 A 人工合成目的基因B 目的基因与运载体结合C 将目的基因导入受体细胞D 目的基因的检测和表达 C 练习 大肠杆菌 EcoRI 的一种限制酶能识别GAATTC序列 并在G和A之间切开 限制酶 什么叫平末端 平末端是如何形成的 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时 切开的DNA两条单链的切口 是平整的 这样的切口叫平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时 产生的是平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时 产生的是黏性末端 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口 可产生几个黏性末端 一个目的基因有几个黏性末端 要切两个切口 产生四个黏性末端 两个 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割 会怎样呢 会产生相同的黏性末端 限制性内切酶来自哪里呢 思考题 大多数来自于原核生物 什么叫做分子杂交 分子杂交技术的种类有哪些 分别有什么应用 3 PCR原理 在80 100 C的温度范围内 DNA的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为变性 当温度缓慢降低后 两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 多聚酶链式反应扩增DNA片断 高温解决了打开双链的问题 但是 又导致DNA聚合酶失活的问题 耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题 促成了PCR技术的自动化 4 TaqDNA聚合酶的应用 5 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出 6 PCR技术的特点 7 细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 PCR过程需要的引物不是RNA 而是人工合成的DNA单链 其长度通常为20 30个脱氧核苷酸 8 细胞内复制和PCR不同点 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 五 PCR的反应过程 1 PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环 每次循环可以分为三个基本步骤 变性 复性和延伸 变性 模板DNA解旋 模板DNA经加热至900C以上 一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使成为单链 以便于它与引物结合 为下轮反应作准备 2 循环过程 复性 退火 模板DNA经加热变性成单链后 温度降到500C左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料 以母链为模板 按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理 合成一条新的DNA链 3 30次循环后靶序列扩增的数量 4 PCR循环的结果 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列 使这段固定长度的序列呈指数扩增 从第二轮循环开始 上一次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的DNA单链会与引物 结合 进行DNA的延伸 二 PCR的实验操作 1 PCR仪 一 设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 PCR仪 1 准备 2 移液 二 实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 过程 盖严微量离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 注意 3 混合 B 手指轻轻弹击微量离心管的管壁 目的是使反应液混合均匀 A 离心管口的盖子一定盖严 防止实验中脱落或液体外溢 将离心管放入PCR仪上 设置好PCR仪的循环程序 过程 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 4 离心 5 反应 离心目的 使反应液体集中在离心管底部 提高反应效果 PCR技术高度灵敏 为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验 PCR操作时要注意做到 6 注意事项 隔离操作区 所用微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头 一 理论上DNA扩增数目的计算 三 课题成果评价 1 一条DNA 复制n次 DNA为2n 2 a条DNA 复制n次 DNA为ax2n 二 实验中DNA含量的测定 1 原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与DNA的含量有关 2 过程 稀释 2uLPCR反应液 加入98uL蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100uL至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 计算 DNA含量 g 50 x 260nm的读数 x稀释倍数 50 1 g ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0 02 比色杯 四 课题延伸 例如 PCR产物每轮循环增加一倍 30轮循环扩增量达230个拷贝 109拷贝 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出特点 五 实验小结 PCR仪加热使 变性 复性使引物与模板DNA 延伸需将反应温度升至中温 在 的作用下 以 为原料 以 为复制的起点 合成新链 如此重复改变反应温度 经 三个阶段为一个循环 每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍 一般样品是经过30次循环 最终使基因放大了数百万倍 将扩增产物进行电泳 经溴化乙锭染色 在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带 模板 互补 Taq聚合酶 四种脱氧核苷酸 引物 变性 复性和延伸 72 基因工程的基本操作程序 第一步获得需要的目的基因第二步构建表达载体第三步导入受体细胞 得到转基因生物第四步目的基因检测与鉴定 获得需要的目的基因常用的方法 1 直接从基因文库中获取 构建文库的方法 1 直接从生物体中提取总DNA 构建基因组DNA文库 genomicDNAlibrary 从中调用目的基因 2 以mRNA为模板 反转录合成互补的DNA片段 建立cDNA文库 3 利用聚合酶链式反应 PCR 特异性地扩增所需要的目的基因片段 等等 2 人工合成 第一步获得需要的目的基因 外源基因 基因组DNA文库的构建将总DNA经过酶解 经蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳分离不同长短的DNA片段 包含的基因组片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上 转染细菌或体外包装到噬菌体颗粒上便构成了该生物的基因组文库 cDNA文库的构建 mRNA反转录cDNA 互补DNA 第二条DNA链 聚合酶链式反应 PCR PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增 包括分离 一段目的基因的技术 加入4种物质 1 作为模板的DNA序列 2 与被分离的目的基因两条链各自5 端序列相互补的DNA引物 20个左右碱基的短DNA单链 3 TaqDNA聚合酶 4 dNTP dATP dTTP dGTP和dCTP 聚合酶链式反应 PCR 变性 退火 延伸三步曲 变性 双链DNA解链成为单链DNA退火 部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸 以目的基因为模板 合成互补的新DNA链 聚合酶链式反应 PCR 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得 230 1 07 109 个基因片段 PCR 多聚酶链式反应 基因重组和克隆操作最重要的工具是 1 限制性内切酶2 DNA连接酶3 运载体 第二步构建基因表达载体 载体的特点 第三步将目的基因导入受体细胞 导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法导入动物细胞显微注射技术导入微生物细胞 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤 1 获得目的基因和质粒载体 2 形成重组质粒 3 制备感受态细胞 用重组质粒转化大肠杆菌细胞 4 培养大肠杆菌 让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝 第四步目的基因的检测与鉴定 分子杂交种类1 按其分子种类划分1 DNA杂交 探针为DNA或RNA2 RNA杂交 探针为DNA或cDNA 3 蛋白质免疫分析 探针为抗体 2 按样品制备过程划分1 转移杂交或印迹杂交 blottinghybridization 先纯化样品 然后使不同大小的分子在