《高效液相色谱HPL》PPT课件.ppt

高效液相色谱HPLC 生物分析小组作业 组长 姬付博小组成员 李云峰 向治霖 华俊豪 赵琳琳 张阳 刘鸣军 魏友武 董鹏 杨睿 罗静 查效兵 周桃 李建月 目录 基础知识应用及举例 色谱是什么 色谱和层析的原理是一样的 只不过我们很多人通常认为色谱是在柱状填料中进行的 而层析则是在薄层介质上进行的 因此层析有时候称为薄层色谱 而色谱则被称为柱层析 结论 事实上色谱和层析是同样的概念 英文单词都是Chromatography 我们都有用纸层析法分离叶绿素的经历 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特 Tswett 在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的 色谱法 Chromatography 因之得名 色谱法的发现 薄层色谱 常见的薄层色谱 也就是纸层析 色谱法的分离原理 溶于流动相 mobilephase 中的各组分经过固定相时 由于与固定相 stationaryphase 发生作用 吸附 分配 离子吸引 排阻 亲和 的大小 强弱不同 在固定相中滞留时间不同 从而先后从固定相中流出 又称为色层法 层析法 高效液相色谱法 HighPerformanceLiquidChromatography HPLC 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支 以液体为流动相 采用高压输液系统 将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂 缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱 在柱内各成分被分离后 进入检测器进行检测 从而实现对试样的分析 该方法已成为化学 医学 工业 农学 商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀 小颗粒具有高柱效 但会引起高阻力 需用高压输送流动相 高效液相色谱HPLC 特点 高压 压力可达150 300kg cm2 色谱柱每米降压为75kg cm2以上 高速 流速为0 1 10 0mL min 高效 理论板数可达10000以上 在一根柱中同时分离成份可达100种 高灵敏度 紫外检测器灵敏度为0 01ng 荧光和电化学检测器可达0 1pg 柱子可反复使用 用一根色谱柱可分离不同的化合物样品量少 容易回收 样品经过色谱柱后不被破坏 可以收集单一组分或制备 理论板数是指在一些分离操作中为完成某一指定分离要求所需理论塔板的数量 按分离机制分类 液 固色谱法LIQUID SOLIDADSORPTIONCHROMATOGRAPHY 固定相 固体吸附剂为 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点 大多数用于非离子型化合物 离子型化合物易产生拖尾 常用于分离同分异构体 液 液分配色谱LIQUID LIQUIDPARTITIONCHROMATOGRAPHY 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法 NPC 和反相色谱法 RPC 正相色谱法 采用极性固定相 如聚乙二醇 氨基与腈基键合相 流动相为相对非极性的疏水性溶剂 烷烃类如正已烷 环已烷 常加入乙醇 异丙醇 四氢呋喃 三氯甲烷等以调节组分的保留时间 常用于分离中等极性和极性较强的化合物 如酚类 胺类 羰基类及氨基酸类等 反相色谱法 一般用非极性固定相 如C18 C8 流动相为水或缓冲液 常加入甲醇 乙腈 异丙醇 丙酮 四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间 适用于分离非极性和极性较弱的化合物 RPC在现代液相色谱中应用最为广泛 据统计 它占整个HPLC应用的80 左右 离子交换色谱ION EXCHANGECHROMATOGRAPHY 固定相 离子交换树脂 流动相 阴离子离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换 根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 应用 离子及可离解的化合物 有机酸 氨基酸 多肽及核酸 离子对色谱IONPAIRCHROMATOGRAPHY 又称偶离子色谱法 是液 液色谱法的分支 原理 它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后 在非极性固定相中溶解度增大 从而使其分离效果改善 主要用于分析离子强度大的酸碱物质 分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐 如戊烷磺酸钠 辛烷磺酸钠等 另外高氯酸 三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对 分析酸性物质常用四丁基季铵盐 如四丁基溴化铵 四丁基铵磷酸盐 反相离子对色谱 非极性的疏水固定相 C 18柱 含有对离子Y 的甲醇 水或乙腈 水作为流动相 试样离子X 进入流动相后 生成疏水性离子对Y X 后 在两相间分配 排阻色谱色谱SIZE EXCLUSIONCHROMATOGRAPHY 固定相 凝胶 具有一定大小孔隙分布 原理 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 溶剂分子小 故在最后出峰 它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离 全部在死体积前出峰 常用于分离高分子化合物 如组织提取物 多肽 蛋白质 核酸等 小分子量的化合物可以进入孔中 滞留时间长 大分子量的化合物不能进入孔中 直接随流动相流出 死体积 deadVolume Vm 指色谱柱在填装后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间 色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和 死体积本意是指色谱柱中未被固定相占据的空隙体积 也即色谱柱内流动相的体积 但在实际测量时 它包括了柱外死体积 色谱仪中的管路和连接头间的空间以及进样系统和检测器的空间 当柱外体积很小时 可以忽略不计 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力 进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 环氧 联胺等 再连接上配基 酶 抗原等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留 改变淋洗液后洗脱 亲和色谱 AC AFFINITYCHROMATOGRAPH 高效液相色谱的应用 医药研究 食品分析 环境污染 精细化工 医药研究 高效液相色谱法由于具有高选择性 高灵敏度等特点 已成为医药研究的有力工具 人工合成药物的纯化及成分的定性 定量测定 中草药有效成分的分离 制备及纯度测定 临床医药研究中人体血液和体液中药物浓度 药物代谢物的测定 新型高效手性药物中手性对映体含量的测定等 所有这一切都需用到高效液相色谱的不同测定方法予以解决 医药应用举例 巴比妥类药物 镇静药中以巴比妥类药物应用最多 巴比妥类是丙二酰脲的衍生物 具有镇静 催眠 止痛作用 图6 4 25为巴比妥类药物用反相离子对色谱分离的色谱图 色谱柱为涂布丁腈的LichrosorbRP 2柱 10 m 3 2mm 150mm 流动相为0 01mol L四丁基铵 TBA pH 7 7 流量0 8mL min 检测器为 UVD 254nm 食品分析 食品种类繁多 各种食品具有不同的特性和营养成分 它所包含的糖 有机酸 维生素 蛋白质 氨基酸 脂肪等直接关系人体的健康 在食品生产过程 往往需添加防腐剂 抗氧化剂 人工合成色素 甜味剂 保鲜剂等化学物质 它们的含量过高就会危害人体健康 此外由于环境污染 也会使食品沾污有害的微量元素 农药残留 黄曲霉素等 因此食品分析的重要性日益受到人们的关注 近年来高效液相色谱分析法在食品分析中的应用日益增多 它比化学分析法操作简便 快速 并能提供更多的有用信息 食品分析举例 蜂王浆 蜂王浆中有效成分10 羟基 2 癸烯酸蜂王浆是工蜂采食花粉 花蜜后 由工蜂体内王浆腺分泌出的粘稠状物质 其含有蛋白质 氨基酸 维生素 酶 激素 乙酰胆碱和有机酸等多种营养物质 其中含有的10 羟基 2 癸烯酸 又称蜂王酸 具有抗癌作用它的色谱分析条件是色谱柱ODS 5 m 4 6mm 250mm 流动相为0 03mol L盐酸溶液2甲醇 水 1 55 35 流量为1mL min 室温 以对羟基苯甲酸甲酯 或辛二酸 作内标物 用二极管阵列紫外吸收检测器 UVPOAD 205nm 进行检测 环境污染 高效液相色谱方法适用于对环境中存在的高沸点有机污染物的分析 如大气 水 土壤和食品中存在的多环芳烃 多氯联苯 有机氯农药 有机磷农药 氨基甲酸酯农药 含氮除草剂 苯氧基酸除草剂 酚类 胺类 黄曲霉素 亚硝胺等 环境污染应用举例 农药残留 农药可分为杀菌剂 除草剂和杀虫剂 由化学组成可分为有机氯农药 有机磷农药 氨基甲酸酯 含氮除草剂 苯氧羧酸除草剂等有机磷农药施用后 受热会分解 残留物危害较小 但其自身有强毒性和恶臭味 施用过程会对人畜造成伤害 氨基甲酸酯类农药具有高效 低毒的特点 利用反相键合相色谱分离 精细化工 在精细化工生产中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物 如高碳数脂肪族或芳香族的醇 醛和酮 醚 酸 酯等化工原料 以及各种表面活性剂 药物 农药 染料 炸药等工业产品 都可使用高效液相色谱法进行分析 精细化工应用举例 聚合物 使用凝胶渗透色谱柱分析聚乙二醇标准物的谱图 课本中的应用实例 一 头孢克洛的HPLC测定法 高效液相色谱是近年来发展最快的方法 他能有效的分离供试品中可能存在降解产物 未除尽的原料和中间体等杂质 并能准确定量 适用于本类药物的原料 各种制剂及生物样本的分析测定 Page321 色谱条件和系统适应性实验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 以磷酸二氢钾 乙腈溶液为流动相 流速为1ml min 波长检测为254nm 精取头孢克洛对照品和头孢克洛 3 异构体对照品适量 加流动相溶解并制成每1ml中分别含有头孢克洛及头孢克洛 3 异构体约0 2mg的混合溶液 取20 l注入液相色谱仪 记录色谱图 头孢克洛及头孢克洛 3 异构体的分离度应符合要求 理论板数按头孢克洛峰计算不低于1500 测定法 1 取本品20mg 精密称定 置100ml量瓶中 加流动相溶解并稀释至刻度 摇匀 取20 l注入液相色谱仪 记录色谱图 2 另取头孢克洛对照品适量 同法测定 3 按外标法以峰面积计算出供试品中头孢克洛的含量 规定按无水物计算 含头孢克洛不得少于95 二 血清中阿司匹林和水杨酸的高效液相色谱测定法 经临床验证 低剂量口服阿司匹林 ASA 可抑制血小板过度凝集的疾病 如心肌梗死和手术后的深部静脉血栓形成 并有预防缺血性脑血管病的作用 由于ASA的服用剂量小 而且易水解 因此可采用反相高效液相色谱法快速 灵敏地同时测定人血清中ASA和水杨酸 SA 的浓度 Page152 色谱条件填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶 5 m 色谱柱4 6mm 150mm 流动相为甲醇 水 正丁醇 磷酸 300 200 10 0 05 检测波长为237nrn 内标物为苯甲酸 柱温为室温 内标溶液苯甲酸的甲醇溶液 浓度为0 1mg ml 对照品溶液的制备精密称取ASA和SA对照品适量 加甲醇溶解并制成浓度分别为o 5 ml和o 1 ml的溶液 血清样品的处理与线性关系取血清100 l 置离心管中 加入30 高氯酸溶液50 l与不同浓度的ASA和SA对照品溶液及内标溶液适量 使浓度均为10mg ml 涡旋混合2分钟 离心5分锋 取上清液20 l进样 以对照品浓度为横坐标 峰高比 H标 H内 为纵坐标 求出各自的回归方程和相关系数 ASA回归方程y 5 8 10 5 29 10X r 0 9996SA回归方程y 6 O 10 8 33 10X r 0 9981ASA和SA的线性范围分别为 1 20 g