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载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题 一 获取目的基因 二 重组 三 转化 反转录法反转录 聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造 载体选择 重组方法 受体细胞的选择 转化方法 方法 四 筛选 五 表达 筛选方法 注意的问题 抗性筛选 蓝白班筛选 是否容易产生抗性突变 是否有假阳性 融合表达 包含体表达 分泌型表达 表达方式 一 获取目的基因 目的基因 来源 用途 决定载体和受体细胞的选择 克隆 表达 分泌型表达 融合表达 包含体表达 反转录法反转录 聚合酶链反应法化学合成法对已发现的基因的改造 目的基因提取方法 二 重组 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体 载体 一 载体的选择 载体 表达型载体 如pUC18 19 pGEM T载体 克隆型载体 如pBR322 TA载体 二 重组方法 用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来 1 克隆基因的酶切位点问题2 载体的酶切问题3 连接片段浓度比的问题 需要考虑的问题 1 黏性末端连接 2 平末端连接 3 同聚物接尾连接 4 接头连接法 三 转化 一 受体细胞的选择 大肠杆菌 枯草杆菌 链霉菌 酵母菌 昆虫细胞 家蚕 哺乳动物细胞 中国仓鼠卵巢细胞CHO 植物细胞 拟南芥菜 烟叶 常用的受体 大肠杆菌 用于接受质粒 C600 W3110 HB101 JM83 JM101 Aps Tcs Cms 用于接受l DNA LE392 ED8654 酵母菌 哺乳动物细胞CHO 毕赤酵母 啤酒酵母 重组和转化需要共同注意的问题 目的基因的稳定性 酶切位点载体的酶切位点 选择标记载体的拷贝数 载体和受体的相容性受体的表达系统目的菌对密码子的偏爱 四 筛选 一 筛选方法 二 注意事项 1 遗传学方法 2 物理筛选法 3 核酸杂交法 4 表达产物分析法 1 连接酶用量与DNA片段的性质有关 连接平齐末端 必须加大酶量 一般连接粘性末端酶量的10 100倍 2 在连接带有粘性末端的DNA片段时 DNA浓度一般为2 10mgml 在连接平齐末端时 需加入DNA浓度至100 200mgml 3 连接反应后 反应液在0 储存数天 80 储存2个月 但是在 20 冰冻保存将会降低效率 4 粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定 所以尽管T4DNA连接酶的最适反应温度为37 在连接粘性末端时 反应温度以10 16 为好 平齐末端则以15 20 为好 5 在连接反应中 如不对载体进行去5 磷酸基处理 便用过量的外源DNA片段 2 5倍 这将有助于减少载体的自身环化 增加外源DNA和载体连接的机会 6 麦康凯选择性琼脂组成的平板 在含有适当抗生素时 携有载体DNA的转化子为淡红色菌落 而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落 该产品筛选效果同蓝白斑筛选 且价格低廉 但需及时挑取白色菌落 当时间延长 白色菌落会逐渐变成微红色 影响挑选 7 X gal是5 溴 4 氯 3 吲哚 b D 半乳糖 5 bromo 4 chloro 3 indolyl b D galactoside 以半乳糖苷酶 b alactosidase 水解后生成的吲哚衍显蓝色 IPTG是异丙基硫代半乳糖苷 Isopropylthiogalactoside 为非生理性的诱导物 它可以诱导lacZ的 8 在含有X gal和IPTG的筛选上 携带载体DNA的转化子为蓝色菌落 而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落 平板如在37 培养后放于冰箱3 4小时可使显色反应充分 蓝色菌落明显 五 表达 一 分泌型表达 目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白末端完整 二 包含体表达 能简化外源基因表达产物的分离操作 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定 三 融合表达 目的蛋白稳定性高 目的