中药及天然药物化学的研究现状及发展前景1.doc

精品文档中药及天然药物化学的研究现状及发展前景 姚新生 沈阳药科大学 1999年8月30日 谢谢大会主席的热情介绍。今天，我报告的题目是 中国中药及天然药物化学的研究观状及发展前景 。 众所周知，中国政府于1993年1月正式向全世界宣布：从那一年起，中国开始实行化合物专利，并且将不再允许任何仿制受专利权保护的药物。但是统计资料表明，当时中国合成药品的97为仿制药品。 对于象中国这样拥有12亿人口的大国来说，人民医疗保健所需要的医药品如何才能得到保障呢？如这张幻灯片所示，当时人们提出了种种设想。 例如：生产其他国家已经过专利保护期的药品；从国外进口药品或购买国外专利许可证等；并特别提到发展和使用传统中药制剂。 众所周知，从“神农尝百草”至今，中华民族几千年来之所以能够繁衍昌盛、绵延不断，靠的就是中医中药。中医中药在临床应用了几千年，其疗效经过了实践的检验，并成为世界文化的一朵奇葩。但是由于生产工艺比较落后，质量监控亟待改进，特别是中医独特的哲学思想使一般西方人难以理解，成为中药产品在全世界进一步推广发展的严重障碍。所以，新药研究与开发成为当今十分重要和紧迫的课题。 这张幻灯片说明大陆政府从公布实行化合物专利起，已经采取了一系列推动和激励新药研究和开发工作的措施，诸如；成立国家新药研究领导小组；成立新药研究常务专家委会；向国外派出代表团或邀请国外从事新药研究及管理的专家进行讲学及学术交流，以便学习发达国家进行新药研究和开发的经验；制定一系列旨在保护知识产权和发明的政策和法令；以及激励研究人从事新药研究和开发工作的奖励政策等等。由于迄今仅有五年时间，这些措施一时还难以取得巨大成效。 这里展示了中国的天然药物资源情况。在中国，天然药物有中药、草药、民族药物及民间药、地方习惯用药等。而且，中药多不单用，绝大多数是按照一定的组方规律配伍应用，构成复方（或方剂），传到近邻日本，则称为“汉方药”。同样的药材，由于组方配伍不同，在疗效及副作用方面都会有所差别。实际上。这也就构成了不同的药物。这一点可以说是中药最大的特点。如这张幻灯片所示，现在有据可查的中药总数有6000余种（实际常用中药仅300余种），但由之构成的中药复方（方剂）数量则大约是它的十倍。 中药及方剂的入药方式有饮片、提取物及有效单体等等。饮片是中医传统的药用方式，局限于医院或家庭应用，特点是容易贯彻辨证论治、因病因人而异的中医哲学思想，但不宜作为商品进入市场流通；提取物及其制剂多为工业化生产方式。经过简单加工提取而成，适宜作为商品进入市场流通，工艺过程不特别复杂，但质量监控难度较大。相信在今后相当长的一个时期内，将会成为中药应用的主要形式，如国内外市场目前应用的各种银杏叶制剂以及大陆目前十分畅销、用于治疗心血管疾病的“地奥心血康”药品等；至于中药有效成分单体，如吗啡、阿托品、长春新碱类等，实际上已经进入了现代药物的范畴，成了所谓的“西药”。特点是均为工业化生产方式，生产工艺难度较大，但质量监控均有保障。 这是由 Otto Sticher教授提出的用以从天然药物中研究开发新药的基本设想。显然，新药的研究开发可以在不同水平上进行。例如，我们可以根据天然植物资源的药用历史背景，采用一些有效的活性筛选体系，对天然资源进行活性筛选。这种筛选可以是有选择性的靶向筛选，也可以是随机筛选，以便得到植物活性提取物（active plant extract）或者总活性部位（total active principles）。然后，进行工艺、质量监控和标准化，并进行药效、毒性、临床试验。由此研究开发出的新药曲当于中国国内的二类新药）可以用作植物疗法(phytotherapy)。典型实例如：国际市场目前十分畅销的银杏叶标准提取物及其制剂，以及大陆地区十分畅销的“地奥心血康”药品等。 另外，也可在上述工作基础上，从活性提取物出发，进一步采用生物活性跟踪分离方法（bioactivity一guided isolation）追踪分离到活性成分单体并测定其结构。所得到的活性成分单体进行进一步的药效、毒性、质量监控研究之后，或直接开发成新药，或进行结构修饰后开发成新药，或只作为先导化合物（leading compounds）进行结构改造后制成新药。这样做成的新药可以用作药物疗法(pharmacotherapy）。典型实例如：morphine、taxol等。当然，这一阶段的工作能否成功，关键在于能否从天然资源中得到尽可能多的新的活性化合物。没有新的活性化合物，新药研究就成了无源之水、无本之木。 怎样才能得到更多的新的生物活性化合物呢？这里简单概括了世界各国的成功经验。对中国来说，从已有长期临床实践经验的中药出发去寻找新的活性成分将会是一条成功的捷径。 在寻找新的活性成分时，灵敏、可靠、微量的生物活性筛选体系具有重要的意义。这里展示的是一种建立在稻瘟霉孢子及菌丝变形基础上的活性测试体系，用于从中药及天然药物中筛选追踪抗癌、抗真菌活性成分，已经取得了很好的进展。该筛选体系最初由日本东京大学分子细胞生物研究所岩崎成夫教授等建立，用于从微生物二次代谢产物中寻找抗癌及抗真菌活性成分。这是稻瘟霉孢子经过16小时培养后的正常生长情况。这是在培养基中分别加入vincristin、rhizoxin、ansamytosin等三种已知的抗癌活性化合物后引起孢子及菌丝变形的情况。我们首次将该活性筛选体系应用于中药抗癌活性成分的研究。首先，我们对247种中医经典著作中记载或民间报道用于抗癌治疗的药材进行了活性筛选，结果发现其中10种药材具有较强的活性。随后，对其中活性最强的三种中药或民间药进行了活性成分的追踪分离。 这是中药粉背萆解（Dioscorea collettii var.hypoglauca的根茎）乙醇提取物引起稻瘟霉孢子及菌丝变形的情况，结果显示明显的量效关系。粉背萆解收载于中国药典19851990和1995版，民间广泛用于治疗多种癌症。 采用稻瘟活性筛选体系进行活性成分的追踪分离，从该药材中共分离得到14种活性成分。经现代光谱解析技术并配合经典的化学方法，我们确定了它们的结构。其中，两种为新的结构，6种为从该种植物中首次分离得到。 这是上述活性化合物的体外抗癌活性测试结果。经美国国立癌症研究所（NCI）采用的人癌9个瘤系共60个瘤株进行筛选，其中7个化合物通过了体外活性筛选试验（in vitro），5个化合物经NCI生物活性评价委会的严格评审后，建议进一步进行体内6个实体瘤共12个瘤株的活性测试（in vivo），显示了良好的研究开发前景。 以上实例提示，在中国从天然资源中寻找新的活性成分时，应当充分注意利用中国丰富的中草药资源以及临床积累的丰富经验。但这里，研究工作的思路事实上与西方没有什么差别，中药或民间药也只是作为普通的植物材料对待，谈不上真正借鉴中医药学的独特理论和千百年来积累的丰富的临床经验。下面，我们将进一步介绍如何借鉴中医药学理论进行活性化合物研究的体会。 众所周知，近些年来，由心脑血管障碍引起的疾病发生率与死亡率不断上升。研究防治此类新药一直是我们一项重要的研究任务。按照中医理论，心脑血管疾病均由所谓“血瘀”所引起。如这张幻灯片所示，所谓“血瘀”症的意思是：血液离开了正常的通道离经之血；血液受到了污染恶血、留血、污秽之血；以及血液凝聚或固化积血、血脉凝泣。由此引起的疾病均谓之“血瘀”症。 根据中西医结合开展的现代病理学研究，上述血瘀症的概念可以理解为；血液循环不良；局部缺血；瘀血：血栓形成）。因此，血瘀症可以说是许多心脑血管系统疾病、炎症以及肿瘤的一种共同症候。 另外，当人们进入老年后，皮肤粗糙、色素沉着）老年斑、白内障等经常出现。所有这些，中医也认为是由血瘀症所引起的。当血瘀进一步加深，将会出现下列所谓的老年病，如：动脉硬化、高血压、脑中风、老年性痴呆等等。如果病情进一步恶化，患者将会走向死亡。因此，关于衰老的成因，中医有所谓的“气虚血瘀说”。 根据中医理论，防治心脑血管系统疾病以及减缓衰老过程的原则是激活血液循环系统以及消除血瘀现象，故谓之“活血化瘀”。这在中医临床治疗中是一个非常重要的治疗原则。据统计，在古书要药方剂中记载了420种中药，其中14以上是活血化瘀类药物。而在另一本古书医方集解中包括了795中药复方，其中的123种（l7）左右的方剂具有活血化瘀的效果。 为了搞清这些传统中药及方剂治疗作用的物质基础以及它们的作用机理，我们进行了下列研究工作。首先，我们对中医文献记载有活血化瘀作用的100种中药以及20种方剂，进行了抗血凝活性的系统筛选试验。所用的体外活性测试体系有：血小板聚集抑制活性；血液粘度比；复钙时间；纤维蛋白酶溶解活性。 这些是用于评价抗凝活性的指标。 这些是抗凝活性的筛选结果。在这100种中药中，其中一半以上具有中等强度或较强的抗凝活性。某些中药加人参、甘草、独活等均为本草中记载的上品，自古以来用作保健中药。 在20种方剂中，12种具有中等强度或较强的抗凝活性。其中的有些方剂，如抵当场、补阳还五场等，已经开发成为临床应用的抗血栓药物，流通于中国的药品市场。 在上述活性筛选结果基础上，我们采用抗血小板聚集活性测试体系作为检测方法，进行了生物活性成分的跟踪分离，迄今已经对10种具有较强抗凝活性的中药进行了活性成分研究。作为其中一个实例，我们将介绍中药薤白（葱属植物小根蒜 Allium macrostemon的鳞茎）的研究工作。 薤白收载于中国药典1990版。中医临床主治“胸痹”、“心痛彻背”等症，相当于心绞痛、心肌梗塞等症状。迄今为止，由汉代著名中医张仲景提出的著名方剂中均含有薤白，如“瓜萎、薤白白酒汤”、“瓜萎、薤白、半夏汤”以及“枳实、薤白、桂枝汤”等。在上述抗凝活性筛选过程中，薤白提取物示有较强的活性。 大家知道，中医有所谓“医食同源”之说，即一些中药既可用作药品。又可用作食物。这里展示一张由中国政府正式公布的既可用作药品、又可用作食品的清单，薤白也在其中。这个事实说明：薤白是一味十分安全的中药。 鉴于大量的文献报道，口服葱属植物的汁液或挥发油有预防高血压、动脉硬化及心肌梗塞之功效。此外，并有降低胆固醇、抑制血小板聚集等作用。因此，作为第一步，我们首先对薤白（A.macrostemon）的挥发油成分进行了研究。采用水蒸气蒸馏法从新鲜题白中得到挥发油，收率为01。通过GCMS分析，共鉴定出19种化合物，其中大多数为对称或不对称的烷基取代的二硫及三硫化合物。 为了确认上述鉴定结果，同时也为了测定上述化合物对血小板聚集的抑制活性，我们合成了其中的15种链式含硫化合物。如这张幻灯片所示，与阳性对照药aspirin比较，某些对称的三硫化合物显示出更强的抑制活性。这是它们的半数抑制浓度值。 但是，根据中国药典1990版记载：中药薤白入药时，须将采挖得到的新鲜鳞茎用水浸煮或蒸过后干燥而成。象含硫化合物这样的挥发性成分在干燥药材中其实早已散失殆尽，因此很难说挥发性成分是中药薤白的主要活性成分。另外，考虑到中医多喜欢采用酒提取薤白及其复方制剂，如“瓜篓、薤白白酒汤”、“瓜篓、薤白、半夏汤”以及“枳实、薤白、桂枝汤”三味更方中都有白酒，故决定对其水溶性或醇溶性成分进行进一步研究。 如这张幻灯片所示，市售商品薤白先用75乙醇进行提取。所得乙醇提取物悬浮于水，依次用CHCI3、EtOAc及nBuOH进行萃取，分别得到AM1（CHCI3）AM2（EtOAc） AM-3（n-BuOH）及AM4（水母液）四个部分。进一步活性测试表明：AM-3及AM4两者强烈抑制血小板聚集，而AM-1及AM-2不显示活性。据此，分离的目标集中在nBuOH提取物。这是活性追踪分离程序。最后，26种化合物的结构通过化学手段及光谱分析得以确定，其中的12种为新的甾体皂甙类化合物。 这是从薤白中分离得到的含氮类化合物。其中，adenosine在美国已被FDA批准在临床作为治疗心率不齐的药物。由于 adenosine在薤白中的含量较高，且示有比aspirin较强的活性，故推测adenosine可能是薤白含氮化合物中治疗心血管系统疾病的有效成分之一。 这些是从薤白中分离得到的甾体皂甙类化合物，分为螺甾（spirostanol）及呋甾（furostanol）两个类型，多数为呋甾类化合物。命名为 inacrostemonoside A-L的化合物均为新的甾体皂甙类化合物。 这张幻灯片表明，薤白中得到的某些化合物在体外活性测试中具有强烈的抗血小板聚集抑制活性。adenosine、tryptophan及大多数甾体皂甙显示出强烈的抑制活性。Macrostemonoside A及F分别比aspirin强20和60倍。 由此，我们推测薤白中的挥发性成分如含硫化合物、甾体皂甙以及含氮化合物均为薤白中的抗凝活性成分。但是由于甾体皂甙类成分大量存在于薤白鳞茎中，且其抗血小板聚集活性比含硫化合物要强一些，故在抗凝作用方面必然起着最重要的作用。 现在，我将介绍一种新的从天然药物中筛选生物活性化合物的方法。这种方法最先由日本北海道药科大学鹿野教授提出，其基本设想是：中药化学成分虽然多种多样，但是当作为口服药物应用时，只有那些能被吸收的成分才是活性成分研究的目标。具体的研究方法如这张幻灯片所示，将药材的水或醇提取物给大鼠口服投药，随后在间隔一定时间后分别收集血清、尿及胆汁样品，测定它们的3DHPLC图谱，比较投药前后的差别。随后分离纯化投药之后在血清、尿及胆汁样品中出现的新成分，鉴定它们的结构，探讨它们的活性，研究这些成分的药物动力学及药理学。通常认为，通过这种途径发现的活性化合物才可能是真正的活性成分。当然，它们可能原本就存在于中药及天然药物中，但也可能是在体内吸收、代谢过程中形成的人工产物。 我们采用了这种方法研究了桑薤白皮中的平喘成分。首先，为了搞清目标成分的范围，我们将桑白皮水提取物给小鼠口服投药，并采用3DHPLC分析了20分钟的血样、24小时的尿样以及3到6小时的胆汁样品中的成分。 这是投药前、后血清样品的3DHPLC图谱。与投药前比较，在投药后收集的血清样品中新出现了M-1及M2两种成分。在尿样中检出了三种新出现的成分M -3、M4及M-5。 在胆汁中，共检出了新出现的四种成分M-1、M-3M-4以及M-5随后我们大量收集投药后的血清、尿及胆汁样品，分离纯化了那些在投药后新出现的成分，并采用结构解析技术测定了其结构。 M-1被确定为 mulberroside A； M-2为 cismulberroside A；M-4为oxyresveratrol. M-3为新的代谢产物，其结构确定为oxyresveratrol-2,3-diO一-di- glucuronide。 M-5也是新的代谢产物，确定为Oxyxresveratrol2ODglucuronide3-O-sulfur。 这张幻灯片展示上述目标成分对豚鼠平滑肌的解痉效果。桑白皮中的主 要成分 mulberroside A以及 cismulberroside A对由组胺引起的气管平滑肌痉挛没有表现出解除痉挛的效果。相反，两个代谢产物oxyresveratrol-3-O-glucopyranoside及oxyresvaratrol却显示明显的松驰效果。上述结果表明：虽然 mulberroside A是桑白皮中的主要成分，但真正的平喘有效成分是其代谢产物。显然，如果按照前述常规方法采用体外活性测试手段追踪活性成分时，真正的活性化合物oxyresveratrol将会丢失。因为oxyresveratrol在桑白皮水提取物中的含量极少，它只是由桑白皮的主要成分经口服，由体内代谢后才大量形成。 下面我们再来简单介绍一下中药复方研究问题。如开始提到的那样，中药很少单用，多在中医理论指导下按照一定的原则组方应用，故方剂的数量约为中药数量的十倍以上。由于中医典籍中记载的中药疗效多建立在方剂用药基础上。因此研究中药如不研究复方，可以说抛弃了中国传统医学的优势，脱离了中国的国情。然而，中药复方研究目前存在的问题主要是： （l）多停留于临床疗效观察的阶段，且多数观察由于缺乏明确的双盲对照、方剂原料、组成及制备工艺的不确定性、质量缺乏监控等原因，其结果的可靠性及重现性难以令人置信；（2）中药复方的实验药理学研究虽然逐年增加，但绝大多数也仅限于药效学的观察，而且由于没有化学工作者的有效配合，方剂组成多不稳定，药效重现性较差，难以准确反映复方的药理学作用。 （3）中药化学成分研究基本上沿用西方科学家走过的道路，多停留在单一中药的化学成分或活性成分研究，中药复方极少成为天然药物化学家的研究对象； （4）研究工作经费严重不足，缺乏国家的统一协调、宏观策划与多学科的相互配合。总之，中药复方研究因其难度较大，加上科学技术发展水平的限制，人们对此望而生畏，致使中药复方研究长期以来处于举步艰难、停滞不前的局面。迄今对中药复方治疗作用的物质基础及作用原理依然所知甚少，中药复方研究尚未走出一条中国自己独特的道路： 中药复方研究势在必行。采用现代科学技术方法阐明中药方剂治疗作用的物质基础及作用原理，不仅对阐明中医药理论、将中药方剂推向国际社会具有重要的意义，而且可能是结合国情、发挥传统医药及资源优势，进行创新药物研究的一条重要的有效途径。 我们对中药复方研究的总体思路是： （l）将中药复方作为一个整体进行研究； （2）临床的主要治疗作用，应与实验药理学效果及活性评价指标大体平行； （3）在探讨复方治疗作用物质基础时，“物质分离”应与“活性分离”同步进行，工作中宜采用多指标活性评价体系，以便尽快追踪分离得到目标活性成分； （4）在分离得到目标活性成分基础上，探讨目标活性成分在复方及药材中的分布及含量； （5）在目标活性成分为等剂量条件下进行目标活性成分、单一药材及复方的药效学对比，探讨复方的组方依据及作用原理。 我们设想的中药复方研究的大体程序如下： （l）选择目标处方。应尽可能符合下列条件：临床疗效确切；临床疗效可用现代药理学实验表达；药味尽可能简单，且涉及的药材品种比较明确；防治常见病或疑难病，且能体现中医用药特色；最好是传统的经典方； （2）核定标准处方，并采用现代药理学手段确认标准汤剂的药效。中药复方多水煎服用，且其临床疗效的记载也多立足于汤剂，放在目标处方一旦选定后，应在考察经典遗著及著名中医实践经验的基础上选择标准处方，从产地选购批量的标准药材，按照制定的标准工艺做成标准汤剂，采用现代药理学研究方法正确表达与确认标准汤剂或其冻干粉的临床疗 效。此项工作是整个中药复方研究的前提。 （3）建立多指标活性评估体系： a所选指标应与药效学实验结果平行，并能反映临床的主要药效； b尽可能简单、灵敏、准确，以便能用于指导活性成分的追踪分离过程； （4）追踪分离目标活性成分，直至确定它们的结构： a从己有活性的标准汤剂或其冻干粉出发进行研究； b“物质分离”与“活性分离”同步进行，即在分离过程的每一阶段，均采用上述多项活性评估指标对母体及子体进行活性评估，优选出最强部位，继续追踪分离，直至分得目标活性化合物； c.采用各种现代的结构测试手段测定目标活性化合物的结构： （5）探讨复方治疗作用的物质基础及作用原理 a. 研究目标活性成分的定性、定量分析方法，测定目标活性成分在标准药材及标准汤剂中的分布规律及含量； b在目标活性成分为等剂量条件系，采用药理学手段比较目标活性成分单体及其不同比例混合物、相应的标准药材及其混合物、以及标准汤剂的药效，探讨复方治疗作用的物质基础及作用原理： 我们对中药复方研究的预期结果： （l）阐明中药复方治疗作用的物质基础及作用原理； （2）为结合国情进行创新药物研究开发一条新路。创新药物的可能来源是： a目标活性化合物或其一定比例的混合物本身可能开发成新药； b目标活性化合物可能成为创新药物研究中的先导化合物； c. 原有的中药复方在阐明其治疗作用的物质基础及作用原理后，经改进制剂工艺、并按国际规范化要求控制制剂质量后，可能开发成为新的标准化制剂； d. 原有处方在研究基础上经改进、重新