SDS-PAGE原理解析.ppt

SDS聚丙浠酰胺凝胶电泳原理 丙烯酰胺简介丙烯酰胺是一种有机化合物 别名AM 纯品为白色结晶固体 易溶于水 甲醇 乙醇 丙醇 稍溶于乙酸乙酯 氯仿 微溶于苯 在酸碱环境中可水解成丙烯酸 职业性接触主要见于丙烯酰胺生产和树脂 黏合剂等的合成 在地下建筑 改良土壤 油漆 造纸及服装加工等行业也有接触机会 日常生活中 丙烯酰胺可见于吸烟 经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中 毒性 丙烯酰胺属中等毒类 对眼睛和皮肤有一定的刺激作用 可经皮肤 呼吸道和消化道吸收 在体内有蓄积作用 主要影响神经系统 急性中毒十分罕见 密切大量接触可出现亚急性中毒 中毒者表现为嗜睡 小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病 长期低浓度接触可引起慢性中毒 中毒者出现头痛 头晕 疲劳 嗜睡 手指刺痛 麻木感 还可伴有两手掌发红 脱屑 手掌 足心多汗 进一步发展可出现四肢无力 肌肉疼痛以及小脑功能障碍等 丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性 丙烯酰胺具有致突变作用 可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常 动物试验研究发现 丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤 如乳腺 甲状腺 睾丸 肾上腺 中枢神经 口腔 子宫 脑下垂体肿瘤等 但目前还没有充足的人群流行病学证据表明 食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性 国际癌症研究机构 IARC 对其致癌性进行了评价 将丙烯酰胺列为2类致癌物 2A 即人类可能致癌物 其主要依据为 丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为致癌活性代谢产物环氧丙酰胺 预防 职业性接触者要通过改革工艺 采取工程技术措施等手段 降低工作场所空气中丙烯酰胺的浓度 同时通过加强个人防护 如戴口罩 手套 穿防护服和鞋等 以防止或减少丙烯酰胺进入体内 日常生活中尽量避免过度烹饪食品 如温度过高或加热时间太长 提倡平衡膳食 减少油炸和高脂肪食品的摄入 多吃水果和蔬菜 不要吸烟 由于煎炸食品是我国居民常吃的食物 国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制 开展我国人群丙烯酰胺的暴露评估 并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法 过硫酸铵 TEMED 四甲基乙二胺 系统 在Acr和Bis的溶液中放入这个催化系统后 过硫酸铵 NH4 2S2O8 产生出游离氧原子使单体成为具有游离基的状态 从而发生聚合作用 聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比 这种催化系统需要在碱性条件下进行 例如 在pH8 8条件下7 的丙烯酰胺溶液30分钟就能聚合完毕 在pH4 3时聚合很慢 要90分钟才能完成 温度与聚合的快慢成正比 通常在室温下就很快聚合 温度升高聚合更快 如将混合后的凝胶溶液放在近0 的地方 就能延缓聚合 一般来讲 温度过低 有氧分子或不纯物质存在时都能延缓凝胶的聚合 为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚合 在聚合前须将溶液分别抽气 然后再混合 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornstein 1964 和Davis 1964 设计的 样品和浓缩胶中含Tris HCl pH6 8 上下槽缓冲液含Tris 甘氨酸 pH8 3 分离胶中含Tris HCl pH8 8 系统中所有组分都含有0 1 的SDS Laemmli 1970 样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界 在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域 它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚 此处pH值较高 有利于甘氨酸的离子化 所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后 沿分离胶泳动 从移动界面中解脱后 SDS 蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶 并被筛分而依各自的大小得到分离 甘氨酸 浓缩效应 凝胶由两种不同的凝胶层组成 上层为浓缩胶 下层为分离胶 浓缩胶为大孔胶 缓冲液pH6 7 分离胶为小孔胶 缓冲液pH8 9 在上下电泳槽内充以Tris 甘氨酸缓冲液 pH8 3 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性 在浓缩胶中HCl几乎全部解离为Cl 但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO 蛋白质的等电点一般在pH5左右 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间 当电泳系统通电后 这3种离子同向阳极移动 其有效泳动率依次为Cl 蛋白质 H2NCH2COO 故C1 称为快离子 而H2NCH2COO 称为慢离子 电泳开始后 快离子在前 在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区 电导与电压梯度成反比 所以低电导区有较高的电压梯度 这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动 在快离子和慢离子之间形成 个稳定而不断向阳极移动的界面 由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间 因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成 条狭窄带 这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍 电荷效应 样品进入分离胶后 慢离子甘氨酸全部解离为负离子 泳动速率加快 很快超过蛋白质 高电压梯度随即消失 此时蛋白质在均一的外加电场下泳动 但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同 使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带 但在SDS PAGE电泳中 由于SDS这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物 使蛋白质分子带负电荷 这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别 从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别 此外 由多亚基组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位 这是因为SDS破坏了蛋白质氢键 疏水键等非共价键 与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化 在水溶液中SDS 蛋白质复合物都具有相似的形状 使得SDS PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响 因此 各种SDS 蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同 Acr Bis 产品简介 40 Acr Bis 39 1 即为含40 acrylamide bisacrylamide的水溶液 其中acrylamide和bisacrylamide的比例为39 1 40 Acr Bis 39 1 常用于配制各种PAGE凝胶 例如EMSA凝胶 RPA凝胶等 可以用于蛋白或核酸等的分离 是实验室的常用储备液 保存条件 4 避光保存 注意事项 40 Acr Bis 39 1 有一定毒性 使用时请注意适当防护 为了您的安全和健康 请穿实验服并戴一次性手套操作 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳 这种凝胶是以丙烯酰胺单体 Acrylamide 简写为Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 N N MethylenaBisacrylamide 简写为Bis 在催化剂的作用下聚合而成的 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的 且具有神经毒性 操作时应避免接触皮肤 但在具有自由基团体系时 它们聚合 引发产生自由基团的方法有两种 即化学法和光化学法 电泳槽 SDS PAGE蛋白电泳上样缓冲液 蛋白上样缓冲液 SDS PAGEloadingbuffer 是一种以溴酚蓝为染料 5倍浓缩的SDS PAGE凝胶电泳上样缓冲液 用于常规的SDS PAGE蛋白电泳样品上样 本产品分为还原型和非还原型两种 还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂 使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离 在电泳凝胶上显现多个蛋白条带 选购和使用时请务必注明 仔细区分 注意事项分为还原型和非还原型两种 还原型上样缓冲液中含一定量的DTT或巯基乙醇 有轻微刺激性气味 较易区分 含巯基的试剂有一定的毒性 为了您的安全和健康 请穿实验服并戴一次性手套操作 使用说明1 按每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液的比例 混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液 5X 2 100 或沸水浴加热3 5分钟 以充分变性蛋白 3 冷却到室温后离心数秒钟 混均后再离30秒钟 取上清直接上样到SDS PAGE胶加样孔内即可 4 通常电泳时染料到达胶的底端附近 0 5 1cm 即可停止电泳 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内 一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖 这样可以增加样品的比重 上样缓冲液中的甘油非常重要 起增加粘度的作用 这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中 指示剂监测电泳的行进过程 一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 SDS PAGE蛋白电泳上样缓冲液 考马斯亮蓝 CoomassieBrilliantBlue 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 是利用蛋白质 染料结合的原理 定量的测定微量蛋白浓度的快速 灵敏的方法 考马斯亮蓝G 250存在着两种不同的颜色形式 红色和蓝色 它和蛋白质通过范德华力结合 在一定蛋白质浓度范围内 蛋白质和染料结合符合比尔定律 Beer slaw 此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式 最大光吸收由465nm变成595nm 通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 蛋白质和染料结合是一个很快的过程 约2min即可反应完全 呈现最大光吸收 并可稳定1h 之后 蛋白质 染料复合物发生聚合并沉淀出来 蛋白质 染料复合物具有很高的消光系数 使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高 在测定溶液中含蛋白质5 L ml时就有0 275光吸收值的变化 比Lowry法灵敏4倍 测定范围为10 100 g蛋白质 微量测定法测定范围是1 10 g蛋白质 此反应重复性好 精确度高 线性关系好 标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲 这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠 试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低 但直线弯曲程度很轻 不影响测定 考马斯亮蓝G 250 CoomassiebrilliantblueG 250 测定蛋白质含量属于染料结合法的一种 考马斯亮蓝G 250在游离状态下呈红色 最大光吸收在488nm 当它与蛋白质结合后变为青色 蛋白质 色素结合物在595nm波长下有最大光吸收 其光吸收值与蛋白质含量成正比 因此可用于蛋白质的定量测定 蛋白质与考马斯亮蓝G 250结合在2min左右的时间内达到平衡 完成反应十分