稀土荧光探针检测多巴胺及类似物.ppt

稀土荧光探针检测多巴胺及类似物 答辩人 袁洁导师 赵美萍副教授2003年6月18日 选题背景已有检测方法综述实验部分总结致谢 儿茶酚胺的结构及生理意义 儿茶酚胺 catecholamine CA 的种类 结构和生理意义神经递质在单细胞检测中的意义 Dopamine DA 瑞典神经药理学家Carlsson于1958年首次提出脑内多巴胺 DA 是独立的神经递质正常值范围为血浆 888pmol L 尿 424 2612nmo1 24h 增高会引起嗜铬细胞瘤 心肌梗塞 糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病 而其含量的降低会引起植物神经病变 帕金森病等 Epinephrine E norepinephrine NE 在人体内的正常值范围为血浆 480pmo1 L 尿 0 80nmo1 24h 在人体内的正常值范围为血浆 615 3240pmol L 尿 0 590nmol 24h 对儿茶酚胺的检测手段 稀土荧光探针检测儿茶酚类化合物的原理 单纯的TbCl3 Tb DCTA体系和DOPAC在实验用的波长条件下 298nm 546 8nm 都没有荧光信号 可见体系发光是由于形成了Tb DCTA DOPAC三重络合物并发生了能量转移得结果 DOPAC的荧光图红 激发波长为279nm蓝 激发波长为298nm TbCl3的荧光图红 激发波长为298nm蓝 激发波长为240nm Tb DCTA荧光图玫红 激发波长为240nm绿 激发波长为240nm 三重络合物 Tb DCTA浓度同上 绿 激发波长为298nm Tb DCTA DOPAC体系荧光图绿 激发波长为240nm红 激发波长为279nm蓝 激发波长为298nm 1 三元络合物的形成 三元络合物体系 1 离子缔合三元络合物2 金属离子先后结合两种配体形成三元络合物Tb DCTA CAs体系 Tb与DCTA先行络合 然后Tb余下的空位再与CAs络合 形成三重络合体系 2 三元络合物发光机理 1 配体受激后 单重态 S1 有三种方式退激 a 产生荧光的辐射跃迁 S1 S0 b 系间窜跃 S1 T1 c 无辐射跃迁回基态 ISC 三重态 T1 也有三种退激方式 a 产生磷光的辐射跃迁 T1 S0 b 通过无辐射转移跃迁到Tb3 的激发态 ET c 无辐射跃迁回基态 T1 S0 2 三元络合物发光机理 2 分子内能量转换效率的影响因素 1 配体最低的激发三重态 T1 能量高于Tb的5D4能级的能量2 能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率3 从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和几率相当高 2 三元络合物发光机理 3 儿茶酚胺的磷光发射波长在409nm 417nm 亦即其三重态 T1 的能量高于Tb3 的5D4能级约3800 4000cm 1高量子产率和跃迁几率能量转移速率常数高达1010s 1由水或解离的氧导致的配体三重态 T1 以及Tb3 发光的猝灭也大大减少了 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择 1 Eu3 EDTA体系 2 Eu3 phen体系 小结 最终弃用这两个体系的原因 是其适用的pH范围太低 难以使DA的羟基充分解离形成三元络合物 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择 3 Tb3 EDTA体系 1 Tb EDTA 1 1 浓度均为2mmol L pH 11 ex 300nm em 545nm 加入甲醇 分析纯 CsCl TOPO等尝试敏化 无法得到满意检测限 DA为10 5mol L小结 目前研究最多的体系 适用的pH相对于前两个体系有了很大提高 但是仍然未能达到文献报道的结果 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择 3 Tb3 EDTA体系 2 Tb EDTA 1 1 浓度均为2mmol L pH 11 ex 240nm em 545nm 出现递减结果小结 在 ex 240nm em 545nm 出现的Tb3 特征波长处的递减结果 可能是由于在检测条件下 Tb EDTA体系能发出Tb3 的特征荧光 而待测物与之形成三重络合体系后 激发波长红移 亦即三重络合体系的形成导致了一部分Tb3 特征荧光的猝灭 A CDOPAC Fluro图B CDA Fluro图 实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择 4 Tb3 DCTA体系 20 C时 Tb3 与EDTA的络合常数lgK1为17 93 而与DCTA的络合常数lgK1为20 20 因此本体系可以在更高pH下存在 更利于三重络合物形成 pH影响 0 4mmol LTb3 DCTA 2 10 5mol LDOPAC 横坐标为pH 0 2mmol LTb3 DCTA 4 10 5mol LDOPAC溶液 色谱纯甲醇 重蒸水 9 1 横坐标为5ml样品中10mol LNaOH的体积 表面活性剂的影响 由于水分子对荧光有相当的猝灭作用 体系又是在水相中 因此尝试加入表面活性剂进行改进 期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形成的胶束中得到保护 起到敏化作用 共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠 阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和非离子表面活性剂TOPO 都未起到期望的对体系的改善作用 甲醇含量影响 0 2mmol LTb3 DCTA 4 10 5mol LDOPAC溶液 NaOHfixed 重原子影响 重原子对于荧光体系有时也可起到敏化作用 实验尝试向体系加入了SrCl2 BaCl2 以及CsCl 其中CsCl的加入对体系的荧光有明显得增强作用 最后选择CsCl浓度为0 1mol L 加样顺序影响 Tb DCTA 甲醇 NaOH CsClTb DCTA 甲醇 CsCl NaOHTb DCTA NaOH 甲醇 CsClTb DCTA NaOH CsCl 甲醇Tb DCTA 甲醇 NaOH CsClDCTA 甲醇 Tb NaOH CsCl 实验操作 向5ml比色管中依次加入前述Tb DCTA溶液0 1ml 10mol LNaOH溶液0 04ml 10mol LCsCl溶液0 05ml 色谱纯甲醇4 5ml 混匀 在检测前再加入待测物 用重蒸水定容至5ml 在激发波长为298nm 发射波长546 8nm处用0 5cm比色池测定荧光强度 实验结果 a CDA Fluro图b CDOPAC Fluro图 实验结果 c C邻二酚 Fluro图d C3 4 二羟基苯甲酸 Fluro图 实验结果 1 证明了CAs能够与Tb和另一配体形成三重络合物并发出荧光 2 建立了一个新的用稀土荧光探针检测儿茶酚类化合物的体系 并对实验条件进行了优化