赵明明-磁珠纯化的原理.pptx

磁珠纯化的原理 胶回收 玻璃奶法 玻璃奶的制作1 石英砂磨成325目的玻璃粉 研磨2小时左右 粉末颗粒的大小 指的是粉末可以通过325目的筛网2 50克玻璃粉悬于加有200mL蒸馏水的烧杯中 搅拌混匀后 静置90min 3 将上清转移至离心管中6000g离心10min 4 倒掉上清 将玻璃粉重悬于1 5mL25 的硝酸中 室温放置过夜 新购置的玻璃器皿含有较多的游离碱 需要在酸中浸泡数小时 浸泡后再冲洗干净 5 6000g离心10min 沉淀玻璃粉 6 倒掉上清 将玻璃粉用无菌双蒸水洗涤4 6次 直至pH值中性 7 用无菌双蒸水重悬玻璃粉 配成50 匀浆 8 等分成100 l样品 贮存于 70 待用的样品可贮存于 20 或4 切取目的DNA条带 溶胶 结合玻璃奶 离心沉淀玻璃奶 洗脱DNA 漂洗玻璃奶 操作步骤 原理 玻璃奶 Glassmilk 是一种白色硅颗粒 能结合0 2kb至50kb大小的DNA 双链 单链 线性 环状或超螺旋 DNA与玻璃奶结合原理在高盐状态下 玻璃奶周围的负电荷被打破 并允许DNA的磷酸负电荷与玻璃奶特异性结合 在低盐 H2O或1 TE 时溶解分离 盐浓度DNA100bp 低盐状态下结合率高 pH值pH 7 0 结合率高 磁珠种类 磁珠 超顺磁性纳米颗粒硅磁 MagneticSilicaParticle 磁珠微珠表面包裹一层硅材料 来吸附核酸 其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式 氧化硅羟基磁珠 此种微球具有核壳结构 即超顺磁性核心及无机氧化硅外壳 表面修饰大量硅烷醇基团 硅烷醇基团 羟基 在chaotropic 如盐酸胍 异硫氰酸胍等 存在的条件下 能够和溶液中的核酸通过疏水作用 氢键作用和静电作用等发生特异性结合 而不与蛋白和其他杂质结合 氧化硅羧基磁珠 该磁珠表面修饰有羧基官能团 能够在特殊化学试剂 如EDC 的作用下将蛋白 寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到磁珠表面 可应用在蛋白纯化 核酸纯化 亲和层析 细胞分类筛选 免疫测定分析和临床诊断等多个生物领域 SA磁珠 Fe3O4 SiO2 SA 利用生物纳米表面技术 使重组Streptavidin高密度定向包被到超顺磁性微球表面 其在表面的包被密度高达9 3 1013molecules cm 2 排列均匀 并朝向一致 产品具有较高的生物素结合效率和较低的蛋白及DNA非特异吸附率 每毫克磁珠结合游离生物素的量可达到1200pmol以上 磁珠品牌 AgencourtBioscienceCorporation BeckmanCoulterCompany AgencourtAMPureXPbeadsBrukerDaltonicsGenoPuredsGenopureoligo single strandedDNAs Macherey NagelNucleoMag 96PCROmegaMagbindNGSClean IT96KitNEBNEBNextOligod T 25MagneticBeadsNEBNextProteinAMagneticBeadsAgilentStreptavidinT1magneticbeads 磁珠选择大小 样品起始100 l 0 55 去除大片段后155 l 0 16 large target WhatplaystheroleinsizeselectionisnotAMPurebeads butit sbuffer 磁珠选择大小 stockbuffer 20 PEG8000 2 5MNaCl Tris 磁珠选择大小 Roche 磁珠选择大小 12 lproductwasmixedwith12 lof 12pXP beadsandincubatedatRTfor6minutes Thesupernatantwasthenmixedwith12 lofAMPureXPbeadsand5 lof40 ofPEG8000andelutedwith10 lofnuclease freewater itwasthenagainpurifiedusing12 lofAMPureXPbeadsandelutedin30mLofEBbuffer Forsize selectionusingtheSPRIbeads wereplacedthestockbufferofAMPureXPbeadswitha12 PEG 8000and2 5MNaClsolution 12pXP buffer OnemLofAmpureXPbeadswereplacedonamagneticstandandleftfor10minutes Thesupernatantwasthenremovedandthebea