疾病与人类健康(基因治疗).ppt

基因治疗 概念美国的联邦食品与药品管理局 FDA 于1993年给出的定义是 基于修饰活细胞遗传物质而进行的医学干预 细胞可以体外修饰 随后再注入患者体内 或将基因治疗产品直接注入患者体内 使细胞内发生遗传学改变 这种遗传学操纵的目的 预防 治疗 治愈 诊断或缓解人类疾病 1 体细胞基因治疗 somaticgenetherapy 治疗基因转移到体细胞内使之表达基因产物 以达到治疗目的 只影响受试者本人 而与后代无关 2 生殖细胞基因治疗 germlinegenetherapy 将治疗基因转移到患者的生殖细胞或早期胚胎内的一种基因疗法 永久地改变后代的遗传组成 其目的是要预防后代患特定的遗传疾病 生殖细胞基因治疗是体细胞基因治疗的延伸与扩展 各国均禁止将生殖细胞基因治疗用于临床 我国于1993年制定了 人的体细胞治疗和基因治疗临床研究质控要点 明确规定仅能进行体细胞基因治疗 特点 技术路线的多样性 学科的交叉性 高风险性 高度的靶向性 基因治疗发展经历的3个阶段 第一阶段 70年代 80末 准备时期又被称为 禁锢时期 第二阶段 1989 1995年 狂热时期FDA于1989年批准基因治疗正式临床试验第三阶段 1996 现在 理性时期目前中国有 B型血友病治疗 脑瘤自杀基因治疗 和 Ad P53 已通过国家药审进入临床试用 基因治疗的3Y原则 安全性 safety 有效性 efficacy 稳定性 stability 伦理原则 1 最后选择原则某种疾病在所有的疗法均无效或微效时 2 安全原则安全不仅仅针对个体 更重要的是针对人类 3 知情同意原则基因治疗尚处于实验阶段 必须让患者认识到基因治疗可能的危害4 公正原则目前 基因治疗只能用于治病救人5 保密原则患者的遗传信息 尤其是基因缺陷不泄露给外界 基因治疗中存在的技术难点 突变基因定位与定点修复技术未解决 不能去除或纠正异常基因 目前的基因导入系统尚不成熟 存在结构不稳定 影响基因组的功能以及治疗基因难以到达靶细胞等隐患 转导的外源性基因在细胞内表达难以控制 有一定的随机性 有激活致癌基因或产生野生型病毒的潜在危害 无法保障干预生殖细胞基因而不对后代产生医源性的伤害 常用病毒载体系统 反转录病毒腺病毒腺相关病毒单纯疱疹病毒 1 反转录病毒载体 RNA病毒 基因组大小在8 11kb之间 以基因组RNA为模板反转录出双链DNA 双链DNA能够随机整合到寄主细胞的染色体上 随着寄主细胞的复制而复制 1981年 Wei等构建了第1个反转录病毒载体 临床上应用最多的以小鼠白血病病毒为基本骨架构建的反转录病毒载体 优点 宿主细胞广泛 能够感染不同生物种类的多种类型细胞 能高效的感染分裂细胞 感染率高达100 能使外源基因整合到宿主细胞染色体上 不足之处 1 不能感染非分裂的细胞 2 可能产生具有复制能力的病毒 3 由于是随机整合 可能引起 插入诱变 4 包装外源DNA能力有限 小于8kb 5 要求靶细胞表面要具有反转录病毒的相应受体 新进展 1 慢病毒载体的研究和应用 HIV 1 基因组中存在核定位信号序列 它能够有效感染并整合到非分裂细胞和最终分化的细胞 除G0期 2 人泡沫病毒目前为止 尚未发现有疾病与人泡沫病毒相关 2 腺病毒载体 线性双链的DNA病毒 基因组为36kb 不整合到宿主细胞染色体上 而是以染色体外成分存在 上皮细胞 角膜和消化道上皮细胞具有天然的嗜性 与临床疾病相关的腺病毒通常较温和 很少危及生命 293细胞是由人胚肾细胞经Ad5DNA片段转染后发生转化而形成的细胞 该基因组中整合有AdE1区的片段 可持续表达E1区蛋白 优点 1 人类是腺病毒的天然宿主 所以比较安全 2 该病毒在体外稳定 易于制备与纯化 3 宿主范围广 既可感染分裂细胞 又可感染非分裂细胞 4 可原位感染 特别是肺 可经口服 喷雾 气管内滴注等多途径进行治疗 5 外源基因表达水平较高 不足之处 1 它几乎可以感染所有的细胞 因此缺乏特异性 2 不能整合到宿主染色体上 所以不能持续表达所需产物 表达时间短暂 需重复给予载体制剂治疗 3 因可能刺激免疫反应 使反复治疗的效果会逐渐降低 3 腺相关 腺伴随 病毒载体 线性单链的DNA病毒 基因组在4 6kb 繁殖依赖于辅助病毒 腺病毒和疱疹病毒 生活周期有两个不同的胞内期 1 缺乏辅助病毒时 腺相关病毒感染宿主细胞 其基因组会整合到宿主细胞染色体上 形成潜伏感染状态 2 当有辅助病毒感染同一个细胞时 腺相关病毒基因组DNA就会复制 优点 目前尚未发现该病毒在人体中致病 所以比较安全 感染宿主细胞广泛 包括非分裂细胞和分裂细胞 特别是能够感染神经元和神经胶质细胞 能特异整合于人的第19号染色体长臂末端 减少了插入突变的可能性 外源基因表达稳定 3个月至1 5年 不足之处 难以大量生产复制需要辅助病毒包装外源基因的能力有限 小于5kb临床的应用受到一定限制亟需建立稳定表达rep和cap的细胞系 但rep表达的毒性可能是其困难所在 4 单纯疱疹病毒载体 基因组长约152kb的双链DNA病毒 不整合 对非分裂细胞具有天然的亲和力 对神经系统细胞具有嗜向性 多用于帕金森或脑瘤等神经性疾病的治疗 用作基因转移载体的单纯疱疹病毒主要来源于I型单纯疱疹病毒 HSV 1 优点 宿主范围广 包括大量哺乳动物和鸟类的分裂细胞和非分裂细胞 载体易于操作 包装外源基因的能力大 可插入长达50kb的外源基因 不足之处 野生型单纯疱疹病毒对人类具有明显的致病性 能够从潜伏状态激活 所以目前仅限于某些恶性肿瘤的临床治疗试验 杆状病毒侵入哺乳动物细胞 内吞 HBV肝靶向性基因治疗载体用外源目的基因取代一个或多个HBV编码基因 S C P X 复制需要通过辅助病毒 包装信号 缺失 基因组的反式互补来实现 血友病的基因治疗 血友病B 人凝血因子IX Ad FIX AAV hFIX 反转录病毒临床试验 复旦薛京伦 血友病A 人凝血因子VIII 地中海贫血的基因治疗 珠蛋白基因及其调控序列突变造血干细胞 帕金森病 PD 的基因治疗 酪氨酸羟化酶基因 L 酪氨酸转换成L dopa神经营养因子基因 早老性痴呆 AD 的基因治疗 淀粉样蛋白 amiloidprecursorproteinAPP神经营养因子基因 肿瘤基因治疗的基本策略1 癌基因表达的反义抑制策略 利用反义DNA 反义RNA 核酶 Ribozyme 技术 抑制癌基因的表达 可以抑制肿瘤 c myc的反义核酸在淋巴瘤细胞中有抗增殖活性 以反向K ras质粒转染小细胞肺癌细胞株 抑制了K ras的表达 并且抑制肿瘤在裸鼠体内的生长 采用ras癌基因特异的核酶 用逆转录病毒导入膀胱癌EJ细胞 发现肿瘤细胞的致癌性和转移性均降低了50 肿瘤基因治疗的基本策略2抑癌基因克隆和表达策略 在目前已分离克隆的抑癌基因中 对RB p53 nm23等在肿瘤治疗方面的作用研究最为深入 恢复视网膜母细胞瘤 小细胞肺癌等肿瘤细胞中RB基因的表达对于这类肿瘤的治疗具有一定的临床价值 以野生型p53基因替换肿瘤细胞中突变的p53基因是p53基因治疗最基本的应用策略 恢复肿瘤细胞中nm23基因的表达对于防止肿瘤的转移具有积极意义 肿瘤基因治疗的基本策略3 宿主免疫功能增强策略 向肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞 TIL 中导入细胞因子基因或肿瘤相关性抗原基因 B7共刺激分子基因等 可以增强宿主抗肿瘤免疫功能 目前用于临床的细胞因子有IL 2 TNF IFN GM CSF等 肿瘤细胞逃逸机体免疫反应的原因之一是许多肿瘤细胞缺乏B7共刺激分子 将B7基因导入肿瘤细胞中 再还输小鼠体内 无B7的小鼠1月后半数致死 导入B7的小鼠全部度过3月的实验期 肿瘤基因治疗的基本策略4 肿瘤治疗药物前体的转换策略 又称自杀基因 suicidegene 疗法 将自杀基因导入细胞中 这些基因的产物可将无害的药物前体转变为有毒的产物 从而将细胞杀死 目前常用的自杀基因有单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因 HSVTK 和细菌的胞嘧啶脱氨酶基因 CD TK能将无毒的GCV转化为有毒的三磷酸GCV CD能催化5 氟胞嘧啶转化为5 氟尿嘧啶 这些转化产物在DNA复制时掺入DNA分子中 抑制