遗传病基因治疗.doc

遗传病基因治疗一、 遗传病基因治疗技术的原理1. 基因治疗是把具有正常功能的基因，通过特殊的基因载体(如病毒)或机械性方法(如微量注射)，引入患某种遗传病的患者细胞内，达到根治遗传病的目的。基因治疗可以分为两类，一是体细胞基因治疗，二是生殖细胞基因治疗。前者较易于进行，后者则技术上较为复杂，并且关系到伦理问题，目前基本没有在人体上进行。2. 基因治疗的基本要求1) 在试验动物中证明所插入的基因能正确进入靶细胞中2) 插入的基因能够存留在靶细胞中并且发挥作用3) 基因表达的水平适当，并且受机体控制4) 对细胞无损害二、 遗传病基因治疗技术的产生1. 在70年代初，科学家们提出所谓的治疗由缺陷基因引起的遗传性疾病“基因手术”。 2. 1990年9月14日，四岁的Deserve患有一种罕见的遗传性疾病称为严重联合免疫缺陷病（SCID），成为在美国第一位接受基因治疗的人。由于Deserve不能产生腺苷脱氨酶（ADA），因此没有一个健康的免疫系统，这使她非常容易受到严重威胁生命的感染。医生从她的身体中取出白血细胞，让细胞在实验室中生长，插入缺失的基因，然后注入患者的血液中。 实验室测试表明，该疗法能够加强Deserve的免疫系统。3. 第一个批准基因治疗的过程中充满着争议。人类基因治疗是非常复杂的，有许多技术仍然需要开发和实验。公众以及政策对于人体基因工程材料的可能用途的辩论也是同样的复杂。三、 遗传病基因治疗技术发展历史1. 基因治疗的发展划分为 3 个历史阶段1) 准备期间(19801989 年) 这是基因治疗的“禁锢时代”。20 世纪80 年代初，从学术界到宗教、伦理、法律各界,对基因治疗能否进入临床存在争议很大。直到 1989 年，美国联邦食品与药品管理局（FDA）才同意将载体导入作为“基因标记”的临床试验，1990 年才正式批准其临床试验。在此期间，科学家们进行了大量的研究工作，同时也在舆论上做了很多准备工作。2) 狂热期 (19901995 年)1990年9月，美国国立卫生研究院的 Anderson和 Base将腺苷酸脱氨酶 (ADA) 基因用反转录病毒导入人自身 T 淋巴细胞，经体外扩增后输回患者体内 ,成功治愈一位由于 ADA基因缺陷导致严重免疫异常的4岁女孩。自此，基因治疗的内容也由单基因遗传病扩大到多基因的肿瘤、艾滋病、心血管病、神经系统疾病、自身免疫疾病和内分泌疾病等。在短短数年内，美国就有100多个临床方案经FDA批准进入临床试验。科学家在前10年所作的储备在这时几乎倾巢而出，其中一些还没有成熟到可以取得疗效的方案也过早地进入了临床试验。3) 理性期 ( 1996 年至今 )随着一位 18 岁的美国青年在美国宾夕法尼亚大学人类基因治疗中心接受治疗时不幸死亡，成为被报道的首例死于基因治疗的患者。基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道, 人们开始对基因治疗的前景进行冷静的思考与反思，基因治疗的研究与发展也遇到了前所末有的压力与挑战。四、 遗传病基因治疗技术现状许多人赞同的体细胞疗法，但毫不犹豫地怀疑允许种系基因疗法可能会带来对未来不可预见的影响。也有人认为，经过适当的调控和保障，种系基因疗法是一种迄今取得的进展逻辑的延伸，道德上可以接受的程序。1. 体细胞疗法1) 基因诊断指查出致病基因或与疾病密切有关的基因，可通过基因产物的检测来实现。所用方法还有基因探针、限制酶酶谱分析、基因体外扩增(即多聚酶链反应，简写作PCR)等多种技术。2) 靶细胞选择转基因治疗中的靶细胞选用应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地、长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以目前的观点看，骨髓细胞是唯一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此，不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症（即前文提到的严重联合免疫缺陷病SCID）、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等的基因治疗都以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。3) 载体选择目前用于转基因的载体有许多，最常用的有质粒、病毒载体。在选择载体时，需要考虑的是载体对机体的毒性、载体所携带的转录启动子启动转录的效率、载体对靶细胞的转染效率等。为了能够携带一些较大的基因(如DNA基因)，近年来也探索了一些用较大的质粒(如人工酵母染色体YAC)来实现大片段基因的转染。4) 目的基因的表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一。为此，可运用基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。5) 转基因过程中注意事项a) 必须考虑到被转基因在靶细胞中具有适当的表达效率。尽管在某些遗传病，正常基因2一5的表达量就可能不会发病，但像珠蛋白生成障碍性贫血等疾病则需要较高的表达水平。b) 被转基因的表达必须受到严格的调控，做到这一点虽然很难，但在某些疾病，过少的基因表达不能达到治疗目的，而过多的表达又会引起不良反应，因此，这就需要严格的体外试验和动物试验。c) 大片段基因的转染以及不分裂细胞的转染都需要特别的考虑，否则难以达到预期效果。2. 种系基因治疗种系基因治疗不仅在技术上更困难，而且也提出了更多的道德挑战。种系基因治疗的主要方法有：1) 治疗前对严重的基因缺陷的母亲进行了胚胎植入（需要在体外授精技术的使用）2) 直接治疗病患成人的生殖细胞（精子或卵子细胞）的遗传缺陷，使缺陷基因不会被传递到他们的后代。 这种方法需要的技术专长，删除有缺陷的基因，插入正常基因。3. 人类疾病基因治疗候选人的标准1) 疾病是无法治愈的，并且受该疾病影响威胁生命2) 其作用器官、组织和细胞类型已经确定3) 对应有缺陷的基因的正常基因已被分离和克隆4) 基因可充分表达（生产足够的蛋白质）5) 技术上可验证程序是安全的4. 当前的基因治疗研究中的急需解决的问题1) 提供更多可供利用的基因: 目前有治疗价值的基因不多。以恶性肿瘤为例 ,能抑制肿瘤生长的基因为数不多；遗传病中多基因疾病的基因尚不清楚。因此，难以达到治疗目的。2) 设计定向整合的载体:基因治疗的基因导入手段要求是高效导入，而且能定向地导人体内某种细胞。已有手段均低效和无导向性。即使导入的基因有治病效果，但由于不能有效地导入，效果也会大受影响。3) 如何高效持续表达导入基因: 导入基因现有的表达量不高，如血友病B 的基因治疗，凝血因子 9 的表达量只有正常人的 5 %，若能达到 10 %，则治疗效果会大大提高。4) 导入的基因做乏可控性: 目前可以做到导入一个胰岛素基因在体内分泌胰岛素，但是如果导入的胰岛素基因分泌胰岛素而不受机体内血糖浓度和激素的调控，后果将会非常严重。因此，急需解决如何对导入基因的表达实现可控调节。5) 靶细胞的类型的选择和细胞移植技术6) 更有效的动物模型：获得性和遗传性疾病的基因治疗，都需要更有效的动物模型。7) 基因转移中的副作用和抗体形成问题以上任何一个环节的阻碍，都将造成基因治疗研究的停滞甚至后退，因此我们要对困难有充分的估计，对科研工作的艰巨性、复杂性有全面的认识，才能处乱不惊，乐观地面对种种困难和挑战，取得科研工作中的进步与提高。5. 全球基因治疗临床试验情况自从1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验以来，世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。截止到1995 年，全世界共有100 多个基因治疗临床方案，但在美国NIH主持的评估中发现真正有效的方案仅为几个，从而提出必须加强基因治疗中的关键基础问题的研究，加强了对基因治疗临床试验方案的审批和监管力度。从此，基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道，并一直稳健发展。据统计，截至2004 年6 月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有987个，表明基因治疗具有良好的发展前景。在所有的临床试验方案中1) 恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案的首位，占总数的66%；2) 心血管疾病占全部基因治疗临床试验方案的8.1%；3) 单基因疾病占全部基因治疗临床试验方案的9.4%；4) 感染性疾病，主要是艾滋病(AIDS) 占全部基因治疗临床试验方案的6.6%；5) 其他疾病占全部基因治疗临床试验方案的2.9%；6) 基因示踪占全部基因治疗临床试验方案的5.3%。目前这些基因治疗临床方案大多数处于/期临床试验阶段，其中期临床方案有624个，/期204个，期131个，/ 期11 个，期17 个。目前只有我国的重组腺病毒p53抗癌注射液(商品名“今又生” )作为世界上第一个基因治疗产品正式上市，这不仅标志着我国能够在“点”上取得世界性的科技突破，也意味着我国有能力在生物高技术产业化进程中抢占先机；7) 总的来说，在基因治疗基础研究和临床试验及产业化各个领域，美国均领先于世界，其临床方案有662 个，占世界上总数的67%。8) 但是也存在一些有效性和安全性的问题，例如：a) 目前进入期临床试验的只有17 个，而且大多数临床试验疗效有限；b) 法国巴黎Necker儿童医院因SCID接受基因治疗的患者中有三名出现了类白血病样症状，表明基因治疗安全性问题有待于进一步解决。五、 遗传病基因治疗技术的发展趋势基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入到特异的细胞。在过去的40年，基因疗法已经为诸如癌症、心血管疾病、人类免疫缺陷病毒（HIV）、血友病隐性单基因疾病等许多疾病的进行了临床研究。 迄今为止，在28个国家已有超过1,340基因治疗临床试验完成、正在进行或已获得批准，使用超过100个基因。 这些（66.5）的临床试验大多是针对癌症的治疗。1. 基因治疗面临的问题和挑战基因治疗的发展经历了“乐观与热情失望与怀疑理性与挑战”的过程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要瓶颈在于有效性和安全性。基因治疗领域的关键问题，其核心问题在于基因治疗的靶向性，目前全世界范围内的科学家都在不同层面上对这些问题进行深入研究。主要表现为：1) 基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。如以腺病毒为载体的p53基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆转录病毒介导ADA 基因转移成功治疗SCID 的病例，因为导入效率较低，前后经历了11 次体外转导和回输。2) 逆转录病毒载体的局限性。目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险。而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。 3) 表达方式和表达水平的局限性。理想的基因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在体内的转录调控机理的认识有限。2. 基因治疗的发展方向目前，在基因导入载体方面出现了两大主流：1) 病毒载体系统：病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70%的治疗方案采用了病毒载体，包括各种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒等。这些病毒载体有各自的特点，同时也存在各自的局限性。a) 逆转录病毒：逆转录病毒具有能够选择性感染分裂细胞，并整合到宿主细胞DNA上，长期存在于宿主基因组中等特点，使之成为第一个利用病毒进行基因转移的工具。但是，重组逆转录病毒的感染和转导效率较低，外源基因随机插入，可能导致基因突变。b) 慢病毒：为了提高基因导入效率，近年来新建立了慢病毒载体系统，它不仅能整合到分裂细胞DNA 中，也能整合非分裂细胞。慢病毒载体对淋巴细胞、干细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率，因此倍受关注。c) 假型逆转录病毒载体：新建立的假型逆转录病毒载体，不依赖细胞表面的特异性受体，具有更广泛的宿主范围。d) 腺病毒载体：腺病毒载体是基因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点；但第一代腺病毒仍然存在许多缺点，如外源基因表达时间短、免疫原性较强、细胞毒性等。近年来对腺病毒载体的改造非常活跃，产生了许多更安全、更有效的载体，如无病毒基因的无肠型腺病毒载体、靶向性病毒载体、复制型腺病毒等。此外，还必须深入研究逆转录病毒诱发癌症的机理，构建更为安全的载体。2) 非病毒载体系统：由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20%；但非病毒载体的生物安全性更好，特别是靶向性的脂质体、靶向性的多聚物，以及脂质体/ 多聚物/DNA复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。3. 赞成人类种系基因疗法的论点：1) 种系基因治疗提供了一种真正的治疗，不是简单地缓解或对症治疗2) 种系基因疗法可能是解决一些遗传性疾病的唯一的有效途径3) 减少生殖健康需求的准父母传送严重遗传性疾病的风险4) 公众有权自由查询，可以再一个可接受的范围内进行人类研究4. 各个国家、地区和组织对于基因治疗的看法和规定1) 美国：美国医学协会批准的体细胞和种系基因疗法提供：a) 研究符合其理事会伦理和司法事务局的指引临床调查；b) 它坚持严格的安全考虑；c) 基因疗法只用于治疗目的的利用在人类疾病的治疗，而不是为了增强或优生的目的。2) 澳大利亚：澳大利亚国家健康与医学研究委员会、医学研究伦理委员会：a) 体细胞基因治疗某些形式的道德上可以接受，但建议在澳大利亚的研究人员在实验室不承担人体生殖或基因治疗。3) 加拿大：加拿大医学研究理事会：a) 理事会批准了单基因疾病的理论与体细胞疗法，没有其他成功使用。 在可预见的未来，种系基因治疗只有在动物模型才可以进行。4) 欧洲委员会议会大会：a) 根据其对人类生命和尊严的权利支持的基础上，安理会反对种系基因工程，因为这将违反默示的权利一个继承的遗传模式已不被人为改变。 b) 体细胞治疗是可以接受的研究者遵循知情同意和为研究伦理委员会的监督标准准则。5) 欧洲医疗研究理事会：a) 奥地利，丹麦，芬兰，法国，荷兰，挪威，西班牙，瑞典，瑞士，英国和西德同意不允许种系的基因治疗。6) 法国。 国家伦理咨询委员会a) 人类基因治疗在批准的基因治疗研究在法国，委员会把这类研究一些严格的限制。b) 只有体细胞的研究是允许的种系基因疗法被禁止。c) 使用的病毒载体的基因转移，禁止破坏了生殖细胞的恐惧。d) 只有单基因（单基因）的基因缺陷在法国治疗的候选人。7) 荷兰：健康委员会。 a) 荷兰健康理事会批准的体细胞基因治疗，并呼吁对种系基因疗法自愿暂停。8) 斯德哥尔摩：外交部，1991年。a) 研究和对人类的体细胞进行基因治疗实验的目的是道德上可以接受的。 当这种细胞上做基因治疗实验中，必须采取措施，防止不良影响的同时对配子发生。 b) 基因治疗（精子和卵子）提出了“人类的升级”，这被认为是不道德的，因此，严禁问题关系到人类配子。9) 美国。 总统委员会a) 委员会提出的新机构继续对人类基因治疗研究中的监督，并捍卫美国基因治疗的研究。b) 体细胞疗法是类似的其他标准的医疗待遇，并在道德上是可以接受的c) 种系基因治疗并不会拒绝，但无限期推迟由于技术和道德的障碍。10) 西德。 Enqute委员会：a) 委员会的报告基因治疗的关键部分英文翻译提出了有关种系在人类胚胎基因治疗研究中的具体问题。 b) 委员会建议，种系基因治疗者，应列为刑事罪行。c) 体细胞基因疗法，是道德上可以接受的。11) 世界基督教协进会。 a) 安理会呼吁对种系基因疗法，并建议禁止在体细胞基因治疗的严格控制，同时考虑到该技术可能被滥用来对付那些认为是有缺陷的歧视。12) 世界医学协会