第05章 血细胞分析仪

,Clinical laboratory medicine,临床检验仪器学,临床检验诊断学教研室 郝艳梅,2,血细胞分析仪,教学要求掌握血细胞分析仪的概念、库尔特原理。熟悉联合检测型血细胞分析仪器的检测原理，网织红细胞检测原理，血红蛋白检测原理、仪器性能评价和维护。了解血细胞分析仪的分类、基本结构、常见故障和排除及进展。,第五章 临床血液常规检验仪器,P63,3,第一节 血细胞分析仪学习内容,一、血细胞分析仪的分型二、血细胞分析仪的检测原理三、血细胞分析仪的基本结构四、血细胞分析仪的性能指标与评价五、血细胞分析仪的维护及常见故障六、血细胞分析仪的进展七、思考题,4,自动化血细胞分析仪由于操作简便、快速、结果准确及精密度高，少量血液就可完成多项参数的分析，为临床医学提供了更多的诊断信息，现正逐渐取代传统的显微镜计数法而被广泛应用。,血常规化验单,5,显微镜计数法:速度慢、精密度不高，但是“金标准”,不同种类细胞的细胞大小、胞浆中颗粒大小和性质、核形态、 核浆比例等不同。,？,6,一、血细胞分析仪的分型,血细胞分析仪(Blood cell analyzer,BCA)是指对一定体积全血内血细胞数量和异质性进行自动分析的临床检验常规仪器；主要功能是血细胞计数、WBC分类、Hb测定、相关参数计算等。,又称血液细胞分析仪、血液分析仪、血球仪、血球计数仪,7,3,血细胞分析仪分型,按自动化程度： 半自动、全自动,按检测原理： 电阻抗型、激光型、联合检测型等。,按对白细胞的分类水平： 二分群、三分群、 五分类、五分类+Ret等； 血细胞分析流水线。,8,血细胞分析流水线,一台或多台全自动血细胞分析仪机器人(完成条码识别、开盖混匀等)单台或多台推片染色仪轨道计算机,9,检测原理,电学,光学,电阻抗法,射频电导法,激光散射法,分光光度法,染色,非染色,二、血细胞分析仪的检测原理,RBC、PLT计数、低档次仪器WBC计数： 应用库尔特检测原理(微粒子电阻抗血细胞计数原理)五分类和高档次仪器： 大多应用以流式技术为主的联合检测原理Hb检测：多使用光电比色原理,10,血细胞与等渗的电解质溶液相比为相对的不良导体 血细胞电阻值大于稀释液的电阻值。,1.电阻抗型血细胞分析仪检测原理,（一）血细胞分析仪的细胞计数原理,11,Coulter原理：在由外电极、内电极和电解质稀释液组成的电路上悬浮在电解质稀释液中的血细胞经负压吸引通过检测器的微孔时产生短暂的电阻增大变化形成电压脉冲信号并经计算机处理脉冲数被转化为细胞数，脉冲信号幅度则与细胞体积大小呈正相关。,U=R,血液中各种血细胞的体积不同，WBC体积范围1201000fl，RBC在8595fl，PLT在230fl,血细胞计数便是利用它们的体积及数量不同。,为未加入溶血素前体积,体积不同，脉冲大小不同，WBC最大，RBC次之，PLT最小。各种不同大小细胞产生的脉冲信号分别通过：放大、阈值调节和甄别、整形、计数得出各种细胞计数结果。,13,脉冲信号和细胞体积直方图的关系,7,横坐标为血细胞体积大小 纵坐标为不同体积细胞的相对频率。,14,实际进行血细胞分析时： WBC为一个检测器。 RBC和PLT为一检测器。,15,3590 90160 160450,（1）白细胞的检测,细胞悬液加溶血素后送入白细胞检测器。,小细胞群,中间细胞群,大细胞群,16,第一群：小细胞区，主要是LC，体积在35-90fl;第二群：单个核细胞区，也称为中间细胞群，体积在90-160fl，包括MC、Eos、Bas、核左移白细胞、原始或幼稚阶段白细胞；第三群：大细胞区，主要是NC，体积在160fl以上。,提示：原始、幼稚白细胞增多,提示： LC减少和NC增多,提示： LC增多和NC减低,提示：中间细胞群增多,用显微镜人工复检,18,（2）红细胞和血小板的检测,红细胞和血小板共用一个检测器（小孔管）。,19,CPU对血小板和红细胞分布图进行判断,正常人红细胞体积和血小板体积间有一个明显界限，血小板计数准确容易。,20,fL,当血细胞悬液中含有异常血细胞（如小RBC）时，划分界限不清。为使PLT计数有较高的准确性，计算机对PLT和RBC分布图进行判断，将PLT计数的上限阈值判定线放在RBC和PLT分布图交叉部分的最低处计数 。,21,红细胞和血小板检测的直方图,22,红细胞直方图,小RBC且大小不均,- 地中海贫血,MCVRDW,MCVRDW-,红细胞分布宽度（RDW）,23,大RBC且大小不均,MCVRDW,24,血小板直方图,细胞碎片的影响,25,用显微镜人工复检,26,27,2.联合检测型血细胞分析仪检测原理,联合分类技术是以流式技术为基础再联合使用电阻抗、射频和电导、激光散射、细胞化学染色等多项技术进行细胞分析，并综合分析检测数据，从而得出较为准确的五分类结果。共有特点是：均使用了鞘流技术。,将经试剂稀释、染色、球形化的细胞悬液注入鞘液流中央，单个细胞随悬液和鞘液流两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管。,NC、LC、MC、Eos、Bas、异常细胞,28,Volume conductivity light scatter, VCS,电阻抗技术：检测细胞体积和数量。,(1)容量、电导、光散射联合检测原理,每个细胞接受三维分析，定义到三维散点图的相应位置。,29,射频电导：射频电流，每秒变化大于1万次的高频交流电磁波，能通过细胞膜。细胞膜对高频电流具有传导性，当电流通过细胞时，细胞核和细胞质的理化组份可使电流的传导性产生变化。,电导性(conductivity，C)：采用高频电磁探针，测量细胞内部结构，细胞内核浆比例、胞质颗粒的大小和密度，从而区别体积完全相同而性质不同的两个细胞。,30,激光散射：激光束能穿透细胞，细胞因本身的各种特性(细胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况)可阻挡或改变激光束的方向，产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。,低角度散射光：前向散射光，反映细胞的 数量和体积大小。,高角度散射光：侧向散射光，反映细胞内 核分叶状况和胞浆中的颗粒等情况， 可以区分出颗粒特性不同的细胞群体。 光散射(scatter，S),31,仪器根据细胞体积、传导性和光散射的不同，综合分析三种检测方法的测定数据，定义到三维散点图的相应位置，全部单个细胞在散点图上形成了不同的细胞群落图得出WBC分类值。,使用VCS技术后，每个细胞通过检测区时，接收三维分析，不同的细胞在细胞体积、表面特征、内部结构等方面完全一致的几率很小。,各类白细胞在VCS三维空间中的分布特点,32,立体散点图,平面散点图,33,原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。WBC内部结构近似于自然状态，在水动力系统的作用下，样本被集中为一个直径为30m的小股液流，该液流将稀释细胞单个排列，因是单个通过激光束，故在各个方向都有其散射光。可以从四个角度测定散射光的密度：,（2）多角度激光散射、电阻抗联合检测原理,34,测定细胞大小和数量,测细胞结构和核质复杂性,测细胞内部颗粒和分叶状况成分,10散射,90去偏振散射光,颗粒可以将垂直角度的偏振激光消偏振的特性，区别NC和EOS,35,基于WBC大小、折射率、核形、核浆比值、以及颗粒性质等，均可影响不同角度下的散射光强度。不同WBC在以上几个方面完全一致的几率很小，从而对白细胞进行分类。,0和 90垂直光散射强度： 分为单核（LC、MC、Bas）和多个核（NC、Eos）90垂直光散射和90消偏振光散射强度: 区分NC和Eos0和10 光散射强度: LC、MC、Bas,36,37,这类仪器是应用激光散射与细胞化学染色技术对白细胞进行分类计数。,（3） 光散射与细胞化学联合检测原理,38,激光与过氧化物酶检测通道：不同白细胞的过氧化物酶活性不同，从强到弱依次为：EOS、NC、MC，而LC和Bas则无。因此，细胞经过氧化物酶染色后，胞质内即出现细胞化学反应，以X轴为吸光率（酶反应强度），Y轴为光散射（细胞大小）显示检测结果，每个细胞产生的这2个信号可定位在细胞散点图上。由于LC和Bas均无过氧化物酶活性，仪器获得白细胞4个亚群(EOS、NC、MC、LC+Bas)。,细胞大小,酶反应强度,单细胞,39,酶反应强度,细胞体积大小,40,Bas细胞检测通道：该通道可进一步区分LC和Bas 。 Bas利用“时间差”与红细胞/血小板使用共同的检测通道。,当血液进入Bas通道时（此时RBC、PLT已检测完毕），血液与酸性表面活性剂反应，RBC被溶解，除Bas外，其他所有WBC膜均被破坏，胞质溢出，仅剩裸核。,41,图3-13嗜碱粒细胞通道试剂反应示意图,42,激光照射Bas后，产生散射光的变化，形成二维细胞图。完整的Bas呈高狭角散射，定位于图的上半部，裸核位于图下半部。,43,（4）电阻抗、射频与细胞化学联合检测原理,这类仪器是利用电阻抗、射频这一成熟细胞计数技术结合细胞化学技术，通过4个不同的检测系统对白细胞、幼稚细胞进行分类和计数。 LC、MC和粒细胞检测系统： EOS细胞检测系统: 血液与特殊溶血剂混合，留完整的EOS，电阻抗原理计数。 Bas细胞检测系统： 幼稚细胞检测系统：IMI（immature myeloid information）未成熟细胞信息,44,RF: 射频电流,DC: 直流电,细胞大小的信息,细胞内部结构信息,电阻抗与射频法白细胞分类检测散点图,淋巴、单核和粒细胞检测系统,45,幼稚细胞检测系统检测原理,46,（5）网织红细胞检测原理,RET中嗜碱性物质RNA，在活体状态下与特殊的荧光染料结合 。荧光强度与RNA含量成正比。用流式细胞术检测 RET大小和RNA含量及Hb的含量。,反应前,反应后,RET等与试剂反应前后的变化,荧光(RNA)强度,前向散射光,47,荧光(RNA)强度,Reticulocytes,PLT,RBC,WBC,前向散射光(细胞大小),血细胞分析仪网织红细胞成熟度分类,48,将血液充入到含特殊试剂（抗凝剂、荧光染料）的毛细管内专用离心机上离心，仪器根据血中各种血细胞成份的比重不同分层亦不同的原理，血细胞被吖啶橙染色后，各层细胞会有明显的颜色差异，然后将毛细管放在特殊的判读机上对不同细胞层进行比对定量分析。计算机综合信息处理，得到红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板、血红蛋白等参数。,3.干式离心分层型血细胞分析仪的细胞计数原理(了解),49,(二)血红蛋白测定原理,采用光电比色原理 当液体性质和厚度固定后，则吸光度与液体物质浓度成正比 血细胞悬液中加入溶血剂后，RBC溶解释放出Hb，后者与溶血剂中有关成分结合形成Hb衍生物，进入Hb测试系统特定波长(530550nm)下进行光电比色，吸光度值与所含Hb含量成正比，经仪器计算显示Hb浓度。仪器Hb校正必须以HiCN值为准。,50,血细胞分析仪基本流程,P70,51,基本结构,机械系统电学系统血细胞检测系统血红蛋白测定系统计算机控制系统,三、血细胞分析仪的基本结构,(实验课),52,(一)机械系统 (实验课) 包括机械装置（如全自动血细胞分析仪有：进样针、分血器、稀释器、混匀器、定量装置等）和真空泵，以完成样本的定量吸取、稀释、传送、混匀，以及将样本移入各种参数的检测区。兼有清洗管道和排除废液的功能。,53,(二)电学系统 包括主电源、电压元器件、控温装置、自动真空泵电子控制系统，以及仪器的自动监控、故障报警和排除等,(实验课),54,国内常用的血细胞分析仪，使用的检测技术可分为电阻抗检测技术和流式光散射检测技术两大类,(三)血细胞检测系统,1.电阻抗检测系统,检测器：仪器配两个小孔管，一个小孔管的微孔直径约为80um，用来测定RBC和PLT；另一个小孔管的微孔直径约为100um，用来测定WBC总数及分类计数。,55,(检测器),电阻抗检测系统,56,57,重叠损失补偿,理想情况是细胞一个个的通过小孔，但是孔的直径100um，所以在实际操作过程中，会存在两个、三个甚至更多细胞，一同或前后尾随进入小孔的可能性，这种情况虽然产生脉冲，脉冲幅度比单个细胞要高，但它只能产生一个信号脉冲，使计数有所丢失，这种现象称为重叠损失。,(三)血细胞检测系统,58,细胞A,细胞B,检测脉冲,检测脉冲,59,重叠校正规律：计算值在8000以下时不校正，计数值在800038000时，每计数1000个，补充100个，即在这个范围内，计数电路每计900个便向千位进1，在38000以上时，每计数1000个补充200个，即在38000以上，计数器每计数800个向千位进1。,60,2.流式光散射检测系统,流式光散射检测技术：由激光光源、检测装置和检测器、放大器、甄别器、阈值调节器、检测计数系统和自动补偿装置组成,激光光源,散射光检测器,光电倍增管,荧光检测器,鞘流形式的装置,检测装置,(三)血细胞检测系统,61,(四)血红蛋白测定系统 由光源、透镜、流动比色池、滤光片和光电传感器等组成。,光源灯,透镜,狭缝,流动比色皿,半透反射镜,滤光片540nm,光电池,样品信号A,滤光片,690nm,光电池,参考信号B,62,(五)计算机控制系统,计算机中的微处理器(MPU) -中央处理单元(CPU)：算术逻辑部件、寄存器、控制部件、内部总线、存储器、输入/输出电路。输入/输出电路是CPU和外部设备之间交换信息的接口。外部设备：显示器、键盘、磁盘、打印机等。键盘通过控制电路与内置电脑相连。控制操作功能键有：,电源开关POWER 样品号键 SAMPLE 选择键 SELECT 自动/手动选择键AUTO/MANUAL 重复键REPEAT 计数键COUNT 打印键PRNT 进给键FEED 输入键 ENTER 清除键CLEAR 清洗键 CLEAN,63,四、血细胞分析仪的性能指标与评价,1.测试参数：16-46个不等2.细胞形态学分析：直方图、WBC分类、幼稚细胞提示、RET计数分析。无论多么先进的血细胞分析仪，进行细胞分类都只是一种过筛手段，并不能完全取代人工镜检分类。,（一）仪器的性能指标,P70,结果异常、图异常、仪器报警时要考虑人工复检。,64,3.测试速度：40-150个/小时4.样本量：20-250ul 采血量够、无凝块、无棉纤维、无溶血等；EDTA-K2抗凝， 储存室温2h内；最好用真空采血管。5.工作条件与基本功能 见表5-1 P71 环境温度18-25。 提供中文报告、异常报警、有与实验室信息系统(LIS) 链接功能。6.技术要求。见表5-2、3、4 P71,（一）仪器的性能指标,65,（二）血细胞分析仪的评价,1.精密度： 指重复测定中各次试验结果彼此接近的程度。 用高、中、低值新鲜全血各10份进行评价。 用标准差(SD)或变异数(CV)表示。2.携带污染率： 指含量高的样本对含量低的样本所产生的影响。 取高低2个样品标本，先测定高值样品3次(H1,H2,H3)， 随时测定低值样品3次(L1,L2,L3)。 携带污染率=（L1-L3)/（H3-L3）100。,P72,66,3.总重复性： 包括了重复测定的随机误差和携带污染双重变异因素。 随机取标本20份，常规分别测定即刻的RBC，WBC，Hb及 放置2h，4h后的数值。分别测定RBC、WBC、Hb的重复试 验变异数(CV)。,P72,（二）血细胞分析仪的评价,4.线性范围： 是测试物浓度的变化与试验结果成线性关系的一段。 越宽越好。至少应包括正常范围及常见的病理范围。,67,5.白细胞分类的评价： 重复性：多次测定同一份血液能否得到非常近似的结果。 准确性：与显微镜下分类结果的相关程度。 对异常细胞的灵敏度：观察外周血存在异常细胞，仪器是否能检出。,P72,（二）血细胞分析仪的评价,68,（三）血细胞分析仪的校准,出厂前已经过厂方技术鉴定合格，但由于运输振动或因故障维修后或长时间停用后再启用等原因，以及正常使用半年以上或认为有必要时，都必须对仪器进行校准及性能测试，这对了解仪器性能，发现问题，确保检验质量有重要意义。 一般要求专人保养，按说明书要求用厂家的配套校准物 进行校准。,69,五、血细胞分析仪的维护与常见故障排除,（一）仪器的维护 血细胞分析仪属高精密仪器，应有专人负责，按仪器厂家的的要求进行日保养、周保养、月保养及年终的大保养，并建立仪器保养和维修档案。同时要做好：检测器、液路和机械传动部分的维护 。,(实验课),70,1.检测器的维护采血顺利；防止纤维丝堵孔计数期间，及时按 “反冲”键， 冲掉沉积变性的蛋白质。,关机前对检测器的微孔进行清理冲洗， 并把其浸泡在清洗剂中。定期卸下检测器，用5%次氯酸钠浸泡清洗。,71,2.液路的维护,五、血细胞分析仪的维护与常见故障排除,使用含蛋白酶的清洁液浸泡一夜，再用稀释液反复冲洗干净管道后使用。仪器长期不用时，液路洗后，按数次计数键，充满去离子水。,稀释液导管、清洗液导管、溶血剂导管等，防止细微杂质引起的计数误差。,72,3.机械传动部位的维护,五、血细胞分析仪的维护与常见故障排除,清理灰尘和污物，加润滑油，防止机械疲劳和磨损。,73,（二）常见故障排除,有自我诊断功能，有故障发生时，内置电脑的错误检查功能显示出“错误信息”，并伴有报警声。,五、血细胞分析仪的维护与常见故障排除,74,1.开机时的常见故障。 开机指示灯及显示屏不亮检查电路。 “RBC或WBC吸液错误”提供稀释液、正确连接进液管。2.测试过程中常见的错误信息 “堵孔”：检测器的微孔堵塞是影响检验结果准确性最常见的原因。常见原因：仪器长时间不用、棉纤维、抗凝不充分、蛋白沉积、灰尘等。主要处理方法：按CLEAN键清洗。 其他：“气泡”、“流动比色池”、“噪声”、“溶血剂错误”等,五、血细胞分析仪的维护与常见故障排除,（二）常见故障排除,75,六、血细胞分析仪的进展,仪器测试原理的不断创新 白细胞分类的改进 红细胞和血小板计数原理的改进 新血细胞分析参数的出现各种特殊技术的应用(免疫染色、图像识别)仪器自动化水平的提高无创血液分析仪的上市,76,是