食品酶学课件本第四章固定化酶.ppt

26March2020 1 第四章固定化酶 一 固定化酶的概念二 固定化技术的兴起与发展三 酶和菌体的固定化方法四 固定化酶的特性复习题 26March2020 2 一 固定化酶的概念 固定化酶是指固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶 示意图酶的固定化是指通过某种方式将酶和水不溶性载体相结合 使酶被集中和限制 从而在使用时不再扩散 固定化酶具有稳定性增加 可反复使用并易于和产物分开等优点 克服了游离酶的不足之处 固定化所用的酶可以是经提取分离后得到的一定纯度的酶 也可以是结合在菌体 死细胞 或细胞碎片上的酶或酶系 相应地 前者称为固定化酶 后者称为固定化菌体或固定化死细胞 可见 固定化菌体是固定化酶的一种形式 它不像固定化活细胞 或称固定化增殖细胞 那样 固定化菌体的细胞为死细胞 死细胞可以部分地起到载体的作用 26March2020 3 固定化酶示意图 26March2020 4 二 固定化技术的兴起与发展 一 生物催化剂 酶的显著优点 二 游离酶的不足之处 三 固定化酶的发展简史 26March2020 5 一 生物催化剂 酶的显著优点 酶是生物催化剂 它具有特异 高效 反应条件温和 副反应少等显著优点 因而随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展 工业化生产的酶越来越多 酶的应用也越来越广泛 现在酶在食品 化工 医药 农业 环保 能源和科研等各个领域已取得了显著的成效 酶作为生物催化剂的许多优点是任何无机催化剂无法比拟的 26March2020 6 二 游离酶的不足之处 1 酶的稳定性差 这是酶的最大的弱点 酶的化学本质是蛋白质 对酸 碱 热 有机溶剂等条件易变性失活 2 难于连续化生产 酶一般都是在水溶液中催化反应 与底物和产物混合在反应系统中 反应后酶仍有较高的活力却不易回收利用 这种一次性使用酶的方式 导致成本较高和难以连续化生产 3 终产品的分离提纯困难 由于酶反应后成为杂质与产物混在一起 无疑给进一步的分离纯化带来一定的困难 针对酶的以上不足 改善的方法之一就是固定化技术的应用 26March2020 7 三 固定化酶的发展简史 1916年Nelson和Griffin就曾经将转化酶吸附在炭和氧化铝上 并且证明这种吸附的酶 即固定化酶 具有活性 1953年 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体 经重氮化法活化后 分别与羧肽酶 淀粉酶 胃蛋白酶 核糖核酸酶等结合 制成了固定化酶 1969年 日本的千畑一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶从DL 氨基酸连续生产L 氨基酸 生产成本仅为游离酶生产成本的60 左右 他开创了固定化酶应用于连续化工业生产的先例 是酶应用史上的伟大变革 1971年 召开第一次国际酶工程学术会议 确定了固定化酶的统一英文名为ImmobilizedEnzyme 1973年 千畑一郎等人又采用固定化微生物细胞连续化生产L 天冬氨酸 后来又发展到固定化增殖细胞即固定化活细胞 26March2020 8 三 酶和菌体的固定化方法 一 吸附法 二 包埋法 三 结合法 四 交联法 五 热处理法各固定方法的特点与比较酶固定化方法示意图 26March2020 9 酶固定化方法示意图 26March2020 10 一 吸附法 概念 吸附法是指利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定化的方法 吸附剂 常用有活性炭 氧化铝 硅藻土 多孔陶瓷 多孔玻璃 硅胶 羟基磷灰石等 特点 最大的优点是廉价简便 条件温和酶活损失少 最大的缺点是酶易从载体上解吸附 26March2020 11 二 包埋法 概念 包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中而使酶固定化的方法 分类 据包埋剂和包埋方法不同 又可分为 凝胶包埋法 半透膜包埋法特点 优点是条件温和 缺点是只适于底物和产物都是小分子的酶的固定化 26March2020 12 凝胶包埋法 概念 凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中而使酶固定化的方法 由于该方法是将酶截留在凝胶颗粒内部的网格内 所以也称为截留法 凝胶种类 所用的凝胶可分为天然凝胶和合成凝胶两类 前者常有的有琼脂凝胶 海藻酸钙凝胶 卡拉胶 明胶等 后者包括聚丙烯酰胺凝胶 光交联树脂等 26March2020 13 半透膜包埋法 半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分子聚合形成的小球内的方法 由于半透膜包埋法所形成的固定化酶小球的直径一般只有几微米到几百微米 称为微胶囊 所以 半透膜包埋法也称为微胶囊包埋法 26March2020 14 三 结合法 概念 结合法是指通过离子键或共价键将酶与载体结合在一起而使酶固定化的方法 分类 离子键结合法 共价键结合法 26March2020 15 离子键结合法 载体 常用的载体有DEAE 纤维素 TEAE 纤维素 DEAE 葡聚糖凝胶等离子交换剂 特点 与吸附法相似 具有酶活损失少 结合力弱等特点 在pH值和离子强度等条件改变时 酶易解吸 所以使用时需要严格控制pH值和离子强度等条件 26March2020 16 共价键结合法 载体 常用的载体有纤维素 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 甲壳质 氨基酸共聚物 甲基丙烯醇共聚物等 主要步骤 首先在载体上引入一活泼基团使载体活化 然后使该活泼基团与酶分子中的某一基团反应 形成共价键 酶分子中可以形成共价键的基团有氨基 羧基 巯基 羟基 酚基和咪唑基等 特点 最大优点是酶结合牢固 但成本较高 而且需要注意避免酶活性中心上的基团被偶联而引起酶的失活 或酶在与载体偶联后可能发生活性中心构象的变化而影响催化能力 酶活回收率一般为30 左右 26March2020 17 四 交联法 概念 采用双官能试剂将酶分子连接起来 从而使酶固定化的方法 称为交联法 双官能试剂 常用的有戊二醛 己二胺 顺丁烯二酸酐和双偶氮苯等 双官能试剂分子中含有两个官能团 这两个官能团可与酶或蛋白质的某些基团反应 从而使酶分子之间或蛋白质分子之间发生交联 应用范围 不仅适用固定化酶 也可用于固定化菌体 特点 用交联法制备的固定化酶或固定化菌体 其最突出的特点是结合牢固而酶活损失大 但是尽可能地降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶活力的提高 双重固定法 为了各方法之间可以取长补短 常采用双重固定法 例如可将交联法与一些物理性的方法 如吸附法 包埋法 联合使用 从而制备出酶活损失少 结合牢固的固定化酶或固定化菌体 26March2020 18 五 热处理法 概念 此法是用于菌体固定化的一种方法 它是将含酶的细胞直接进行热处理将酶固定在菌体内从而获得固定化菌体的方法 特点 菌体本身既是酶供体同时也是载体 所以方法简便 但需注意的是 热处理会引起酶的热变性失活 因此 该法只适用于目标酶热稳定性较好时 而且进行热处理时还需严格控制好热处理强度 即严格把握加热温度和时间 热处理法也可与其它固定化方法配合使用 进行双重固定化 26March2020 19 以上四种固定化酶方法各有其优缺点 见表4 1 往往一种酶可以用不同方法固定化 但没有一种固定化方法可以普遍地适用于每一种酶 在实际应用时 常将两种或数种固定化方法并用 以取长补短 各固定方法的特点与比较 四 固定化酶的特性 一 固定化酶的形状 二 固定化酶的性质 三 酶活力 四 固定化酶的稳定性 五 固定化酶的反应特性 26March2020 21 一 固定化酶的形状 固定化酶的形式多样 依不同用途有颗粒 线条 薄膜和酶管等形状 其中颗粒占绝大多数 颗粒和线条主要用于工业发酵生产 如装成酶柱用于连续生产 或在反应器中进行批式搅拌反应 薄膜主要用于酶电极 应用于分析化学 酶管机械强度较大 亦宜用于工业生产 26March2020 22 二 固定化酶的性质 酶在水溶液中以自由的游离状态存在 但是固定后酶分子便从游离的状态变为牢固地结合于载体的状态 其结果往往引起酶的性质的改变 为此 在固定化酶的应用过程中 必须了解固定化酶的性质与游离酶之间的差别 并对操作条件加以适当调整 由于固定化的方法不同 固定化酶的活力和性质也有所不同 26March2020 23 三 酶活力 固定化酶的活力在多数情况下比天然酶的活力低 其原因可能是 酶活性中心的重要氨基酸残基与水不溶性载体相结合 酶与载体结合时 其高级结构发生了变化 其构象的改变导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力的改变 酶被固定化后 虽不失活 但酶与底物间的相互作用受到空间位阻的影响 也有在个别情况下 酶经固定化后其活力升高 可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游离酶活力高 26March2020 24 四 固定化酶的稳定性 游离酶的一个突出缺点是稳定性差 而固定化酶的稳定性一般都比游离酶提高很多 这对酶的应用是非常有利的 其稳定性增强主要表现在如下几个方面 1 操作稳定性 2 贮藏稳定性 3 热稳定性 4 对蛋白酶的稳定性 5 酸碱稳定性 酶的固定化方法不同 所得的固定化酶的操作稳定性亦有差异 固定化酶在操作中可以长时间保留活力 一般情况下 半衰期在一个月以上 即有工业应用价值 固定化可延长酶的贮藏有效期 但长期贮藏 活力也不免下降 最好能立即使用 如果贮藏条件比较好 亦可较长时间保持活力 例如 固定化胰蛋白酶 在0 0025mol L磷酸缓冲液中 于20 保存数月 活力尚不损失 热稳定性对工业应用非常重要 大多数酶在固定化之后 其热稳定性都有所提高 但也有一些酶的耐热性反而下降 一般采用吸附法来进行酶的固定化时 有时会导致酶热稳定性的降低 酶经固定化后 其对蛋白酶的抵抗力提高 这可能是因为蛋白酶是大分子 由于受到空间位阻的影响 不能有效接触固定化酶 例如 千畑一郎发现 用尼龙或聚脲膜包埋 或用聚丙烯酰胺凝胶包埋的固定化天门冬酰胺酶 对蛋白酶极为稳定 而在同一条件下 游离酶几乎全部失活 另外固定化后酶对有机试剂和酶抑制剂的耐受性也得到了提高 多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶 稳定pH范围变宽 极少数酶固定化后稳定性下降 可能是由于固定化过程使酶活性构象的敏感区受到牵连而导致的 26March2020 25 五 固定化酶的反应特性 固定化酶的反应特性 均与游离酶有所不同 1 底物特异性固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有一定关系 1 酶的底物为小分子化合物 2 酶的底物为大分子化合物2 反应的最适pH3 反应的最适温度4 米氏常数5 最大反应速度 26March2020 26 1 酶的底物为小分子化合物 一般来说 当酶的底物为小分子化合物时 固定化酶的底物特异性大多数情况下不发生变化 例如 氨基酰化酶 葡萄糖氧化酶 葡萄糖异构酶等 固定化前后的底物特异性没有变化 26March2020 27 2 酶的底物为大分子化合物 当酶的底物为大分子化合物时 如蛋白酶 淀粉酶 磷酸二酯酶等 固定化酶的底物特异性往往会发生变化 这是由于载体引起的空间位阻作用 使大分子底物难以与酶分子接近而无法进行催化反应 酶的催化活力难以发挥出来 催化活性大大下降 而分子量较小的底物受到空间位阻作用的影响较小 与游离酶没有显著区别 酶底物为大分子化合物时 底物分子量不同 对固定化酶底物特异性的影响也不同 一般随着底物分子量的增大 固定化酶的活力下降 例如 糖化酶用CMC叠氮衍生物固定化时 对分子量8000的直链淀粉的活性为游离酶的77 而对分子量为50万的直链淀粉的活性只有15 17 26March2020 28 2 反应的最适pH 酶被固定后 其最适pH和pH曲线常会发生偏移 原因 酶本身电荷在固定化前后发生变化 载体电荷性质致使固定化酶分子内外扩散层的氢离子浓度产生差异 酶催化反应产物导致固定化酶分子内部形成带电荷微环境 26March2020 29 3 反应的最适温度 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高 如色氨酸酶经共价结合后最适温度比固定前提高5 15 但也有不变甚至降低的 固定化酶的作用最适温度会受固定化方法以及固定化载体的影响 26March2020 30 4 米