序列分析软件DNAMAN的使用方法中文.ppt

序列分析软件DNAMAN的使用方法简介 饶志明博士 教授 博士生导师江南大学生物工程学院工业微生物中心江南大学工业生物技术教育部重点实验室E mail raozhm DNAMAN是一种常用的核酸序列分析软件 由于它功能强大 使用方便 已成为一种普遍使用的DNA序列分析工具 打开DNAMAN 可以看到如下界面 第一栏为主菜单栏 除了帮助菜单外 有十个常用主菜单 第二栏为工具栏 第三栏为浏览器栏 在浏览器栏下方的工作区左侧 可见Channel工具条 DNAMAN提供20个Channel 点击Channel工具条上相应的数字 即可击活相应的Channel 每个Channel可以装入一个序列 将要分析的序列 DNA序列或氨基酸序列 放入Channel中可以节约存取序列时间 加快分析速度 如何使用DNAMAN分析序列 1 将待分析序列装入Channel通过FileOpen命令打开待分析序列文件 则打开的序列自动装入默认Channel 通过Sequence LoadSequence菜单的子菜单打开文件或将选定的部分序列装入Channel 通过Sequence CurrentSequence AnalysisDefination命令打开一个对话框 通过此对话框可以设定序列的性质 DNA或蛋白质 名称 要分析的片段等参数 2 以不同形式显示序列 通过Sequence DisplaySequence命令打开对话框 根据不同的需要 可以选择显示不同的序列转换形式 对话框选项说明如下 Sequence Composition显示序列和成分 2 以不同形式显示序列 ReverseComplementSequence显示待分析序列的反向互补序列ReverseSequence显示待分析序列的反向序列ComplementSequence显示待分析序列的互补序列DoubleStrandedSequence显示待分析序列的双链序列RNASequence显示待分析序列的对应RNA序列 3 DNA序列的限制性酶切位点分析 将待分析的序列装入Channel 点击要分析的Channel 然后通过Restriction Analysis命令打开对话框 参数说明如下 Results分析结果显示其中包括 Showsummary 显示概要 Showsitesonsequence 在结果中显示酶切位点 Drawrestrictionmap 显示限制性酶切图 Drawrestrictionpattern 显示限制性酶切模式图 3 DNA序列的限制性酶切位点分析 Ignoreenzymeswithmorethan 忽略大于某设定值的酶切位点 Ignoreenzymeswithlessthan 忽略小于某设定值的酶切位点 TargetDNA 目标DNA特性 Circular 环型DNA dam dcmmethylation dam dcm甲基化 allDNAinSequenceChannel 选择此项 在SequenceChannel中的所有序列将被分析 如果选择了Drawrestrictionpattern 那么当所有的channel中共有两条DNA时 则只能选择两个酶分析 如果共有三个以上DNA时 则只能用一个酶分析 选择所需的项目 然后按提示操作点击按扭 出现下列对话框 参数说明如下 Enzyme代表 enzymedatafile 点击旁边的下拉按钮 出现两个默认选项 restrict enz和dnamane enz 如果添加过自制的酶列表 则附加显示自制酶列表文件名 其中restrict enz数据文件包含180种限制酶 dnamane enz数据文件包含2524种限制酶 选择其中一个数据文件 相应的酶在左边的显示框中列出 按酶名称字母表顺序 鼠标双击酶名称 则对应的酶被选中 在右边空白框中列出 要自制酶切列表 可以从左边酶列表中双击鼠标选择多种酶 例如puc18multiplecloningsites 然后点击按钮出现下列对话框 输入要保存酶列表的文件名 点击按钮即可保存 自制酶列表可以方便分析特定的酶切位点 Cutter酶切识别序列长度 End酶切产生的末端 其中包括 Blunt 平头末端 5 Overhang 5 突出粘性末端 3 Overhang 3 突出粘性末端 系统根据cutter和end的设定情况 在左边酶列表中显示符合条件的酶 最后 点击按钮执行操作 4 DNA序列比对分析 DotMatrixComparision 要比较两个序列 可以使用DNAMAN提供的序列比对工具DotMatrixComparision 点矩阵比较 通过Sequense Dotmatrixcomparision命令打开比对界面 点击对比界面左上角的按钮 出现下列对话框 参数说明如下 Sequencetype序列类型Sequence1参加比对的第一序列选择框 框内选项说明如下 如果要比对的序列在Channel中 点击下拉箭头 选择相应的Channel 则被选中的Channel中的序列作为参加比对的第一序列 也可以从文件夹中选择参加比对的序列 在File选择框上点击即可 通过Length选择参加比对的序列片段 Sequence2参加比对的第二序列选择框 选项说明同上ShowSequence选择此项 当同源性大于设定值时 将显示同源性 Annotations是否显示注释Comparision比对参数 其中Window代表Windowsize 单位比对长度 Mismatch代表Mismatchsize 单位比对长度中许可的错配值 要快速比对 需将此项设为0 Bothstran代表Bothstrand 双链比对 选择此项 是指用Sequence2中的序列的正链和负链分别和Sequence1比较 Sequence2正链与Sequence1比较结果用黑色点表示 Sequence2负链比对结果用红色点表示 Plotbox点阵图表显示参数 Position 起点坐标 Width 宽度值 Height 高度值 Framesize 边框线粗度值 Dotsize 点粗度值 Gridline 虚线框数 参数设定好后 点击按钮执行操作 5 序列同源性分析 1 两序列同源性分析通过Sequence TwoSequenceAlignment命令打开对话框 如下所示 参数说明如下 Alignmentmethod比对方法 通常可选Quick 快速比对 或Smith Waterman 最佳比对 当选择快速比对时 设置较小的k tuple值 可以提高精确度 当序列较长时 一般要设置较大的k tuple值 k tuple值可选范围2 6 蛋白质序列 k tuple值可选范围1 3 2 多序列同源性分析 通过打开Sequence MultipleSequenceAlignment命令打开对话框 参数说明如下 File从文件中选择参加比对的序列Folder从文件夹中选择参加比对的序列Channel从channel中选择参加比对的序列Dbase从数据库中选择参加比对的序列Remove清除选择的序列 鼠标点击左边显示框中的序列名选择 Clear清除全部序列 点击按钮 出现方法选择对话框 选择其中一种方法 点击按钮 出现下列对话框 如果在前一对话框选择的是Fastalignment 则在此对话框中选择Quickalignment 否则选择Dynamicalignment即可 其它参数不必改变 点击对话框中间的使其它参数取原始默认值 点击左上角按钮 可以从弹出的对话框中选择不同的结果显示特性选项 点击按钮下的按钮 出现下列选择项 可以通过这些选项 绘制同源关系图 例如Tree homologytree命令 显示蛋白质二级结构 ProteinSecondaryStructure命令 绘制限制性酶切图 RestrictionAnalysis命令 等 6 PCR引物设计 首先 将目标DNA片段装入Channel 并激活Channel 点击主菜单栏中的Primer主菜单 出现下拉菜单 点击DesignPCRPrimersforDNA命令 出现下列对话框 参数说明如下 Primerlocationsontarget引物定位其中包括下列选项 Productsize 扩增目的片段大小 Senseprimer 正向引物选择区 Antisenseprimer 反向引物选择区 Primer引物特性包括Length 引物长度 Tm值 GC含量等参数 Rejectprimer引物过滤 将符合引物过滤条件的引物过滤掉 包括下列选项 3 dimer 可形成3 端自我互补的碱基数 Hairpinstem 可形成发卡颈环结构的碱基数 PolyN 多聚碱基 3 Uique 3 端严格配对碱基数 Allmatches 引物互补配对百分数 Consentrations浓度设定ProductforhybridyzatPCR产物用于SouthernBlot探针杂交 7 画质粒模式图 我们常常要用到各种质粒图 无论是制作幻灯片 还是发表文章 常常需要质粒图 DNAMAN提供强大的绘质粒图功能 能满足我们的需要 通过Restriction Drawmap命令打开质粒绘图界面 将鼠标移动到圆圈上 等鼠标变形成 I 时 单击鼠标左键 出现如下菜单 菜单说明如下 Position当前位置AddSite添加酶切位点AddElement添加要素AddText添加文字InsertFragment插入片断CopyFragment复制片断CutFragment剪切片断RemoveFragment清除片断FrameThickness边框线粗细调节 点击AddSite选项 出现对话框 参数说明如下 Name要添加的酶切位点的名称 例如HindIII Position位置 以碱基数表示 点击AddElement选项 出现如下对话框 参数说明如下 Type要素类型 共有三种类型 鼠标点击即可切换 Color Pattern填充色 共有16种颜色供选择 Name要素名称Start End Size要素起点 终点 粗细度 核酸序列的一般分析流程 1 1核酸序列的检索http www ncbi nlm nih gov 80 entrez query fcgi db Nucleotide1 2核酸序列的同源性分析1 2 1基于NCBI Blast软件的核酸序列同源性分析http www ncbi nlm nih gov blast blast cgi1 2 2核酸序列的两两比较http www ncbi nlm nih gov gorf bl2 html1 2 3核酸序列的批量联网同源性分析 方案 1 3核酸序列的电子延伸1 3 1利用UniGene数据库进行电子延伸 方案 1 3 2利用Tigem的ESTMachine进行电子延伸ESTExtractor http gcg tigem it blastextract estextract html ESTAssembly http www tigem ESTmachine html1 3 3利用THC数据库对核酸序列进行电子延伸http gcg tigem it UNIBLAST uniblast html 1 4核酸序列的开放阅读框架分析1 4 1基于NCBI ORFfinder的ORF分析http www ncbi nlm nih gov gorf gorf html1 5基因的电子表达谱分析1 5 1利用UniGene数据库进行电子表达谱分析 方案 1 5 2利用Tigem的电子原位杂交服务器进行电子表达谱分析http gcg tigem it INSITU insitublast html 1 6核酸序列的电子基因定位分析1 6 1利用STS数据库进行电子基因定位http www ncbi nlm nih gov genome sts epcr cgi1 6 2利用UniGene数据库进行电子基因定位 方案 1 7cDNA的基因组序列分析1 7 1通过从NCBI查询部分基因组数据库进行基因组序列的分析 方案 1 7 2通过从NCBI查询全部基因组数据库进行基因组序列的分析http www ncbi nlm nih gov genome seq page cgi F HsBlast html ORG Hs1 7 3通过从SangerCentre查询基因组数据库进行基因组序列的分析http www sanger ac uk HGP blast server shtml 1 8基因组序列的初步分析1 8 1基因组序列的内含子 外显子分析http www bioscience org urllists genefind htm1 8 2基因组序列的启动子分析http www hgc lbl gov projects promoter html 1 9核酸序列的注册1 9 1EST序列的注册 方案 1 9 2较长或全长cDNA序列的注册 方案 1 10待分析序列所对应的已知克隆的获取http image llnl gov 引物设计 引物引物的重要性引物设计的原则引物与PCR引物设计软件如何使用PrimerPremier5 0引物同源性分析 引物 primers 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列 一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补 另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补 3 3 5 5 Senseprimer Antisenseprimer 引物的重要性 在整个PCR体系中 引物占有十分重要的地位 PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合 不与其他非目的DNA结合 PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸 可见引物设计好坏与PCR结果密切相关 引物设计原则 引物长度碱基分布的均衡性Tm值引物二级结构引物3 端引物5 端引物的内部稳定性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构 引物长度 一般为15 30个核苷酸 在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物 但最多不超过50个核苷酸 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40 60 GC含量太低导致引物Tm值较低 使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增 引物Tm值 一般要求 55 65 计算 对于低于20个碱基的引物 Tm值可根据Tm 4 G C 2 A T 来粗略估算对于较长引物 Tm值则需要考虑热动力学参数 从 最近邻位 的计算方式得到 这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式 Tm H S R ln C 4 16 6log K 1 0 7 K 273 15 引物二级结构 引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3 端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3 端形成发夹结构 否则将严重影响DNA聚合酶的延伸 引物3 端 引物的延伸从3 端开始 因此3 端的几个碱基与模板DNA均需严格配对 不能进行任何修饰 否则不能进行有效的延伸 甚至导致PCR扩增完全失败 考虑到密码子的简并性 引物3 端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对 引物5 端 引物5 端可以有与模板DNA不配对碱基 在5 端引入一段非模板依赖性序列 5 端加上限制性核酸内切酶位点序列 酶切位点5 端加上适当数量的保护碱基 5 端的某一位点修改某个碱基 人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究 5 端标记放射性元素或非放射性物质 如生物素 地高辛等 引物的内部稳定性 过去认为 引物3 端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸 故3 端最好为G或C 现在的观点认为 引物的5 端应是相对稳定结构 而3 端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构 即3 端尽可能选用A或T 少用G或C 仅仅3 端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的 如果3 端为富含G C的结构 只需3 端几个碱基与模板互补结合 就可能引发延伸 造成假引发 引物的保守性与特异性 保守性 通用引物 检测同一类病原微生物尽可能多的型别特异性 避免非特异性扩增 扩增区域的二级结构 模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构 在选择引物时 应使扩增区域尽可能避开这些区域 扩增区域的自由能 G 小于58 61kJ mol引物Tm值与PCR产物Tm值相差一般不超过30 Tmproduct 81 5 16 6log K 1 0 7 K 0 41 G C 500 length 引物与PCR 引物浓度 一般为0 1 0 5umol L引物浓度 uM nOD 33 A 312 C 288 G 328 T 303 61 VH2OVH2O 单位 L 退火温度最适退火温度 TaOpt 0 3 Tmofprimer 0 7 Tmof