《发酵工艺控制》PPT课件.ppt

7 3发酵条件的影响及其控制 常规条件 罐温 搅拌转速 空气流量 罐压 补料 加糖 或前体 通氨速率以及补水等的设定和控制 pH 溶氧 DO 溶解CO2 氧化还原电位 rH 尾气O2和CO2含量 基质 如葡萄糖 或产物浓度 代谢中间体或前体浓度 菌浓 以OD值或细胞干重DCW等代表 等 表征过程性质的状态参数 直接状态参数 比生长速率 摄氧率 OUR CO2释放速率 CER 氧得率系数 Yx o 氧体积传质速率 KLa 基质消耗速率 Qs 产物合成速率 Qp 等 间接状态参数 生产菌种的特性发酵条件的控制为掌握生产菌种在发酵过程的代谢规律 通过各种监测手段了解各种状态参数随时间的变化 并予以有效的优化控制 决定发酵水平的因素 建立高产经济发酵过程的关键支撑因素 先进的培养基组成先进的细胞代谢物分析技术先进的统计优化策略 营养过于丰富 菌生长过盛 发酵液黏稠 传质状况差 细胞不得不花费许多能量来维持其生存环境 即用于非生产的能量倍增 对产物合成不利 b 营养缺乏 影响菌体生长和产物形成 培养基过于丰富或缺乏的影响 7 3 1基质浓度对发酵的影响及其控制 例2 谷氨酸发酵中以乙醇为碳源 控制乙醇浓度在2 5 3 5g L 可延长谷氨酸合成时间 例1 酵母crabtree效应 高糖度下 即使溶氧充足 它还会进行发酵产生乙醇 碳源浓度对产物形成的影响 一般随灭菌温度升高 时间延长 对养分的破坏作用愈大 从而影响产物的合成 特别是葡萄糖 不宜同其他养分一起灭菌 7 3 2灭菌情况 种子的质和量影响 发酵期间菌种生长的快慢产物合成的多寡 7 3 3种子质量 一般 种龄是对数生长期的后期 太年轻的种子 过老的种子 不同品种 不同工艺条件的发酵 最适种龄也不尽相同 要经多次试验而定 种龄 常用接种量为5 10 接种量是由菌的生长繁殖速度决定的 大接种量 接种量过大 接种量 7 3 4温度对发酵的影响 不同微生物最适生长温度和耐受温度范围各异 温度对比生长速率与比死亡速率的影响可表示为 1n lnA Ea RT 7 32 1na lnA Ea RT 7 33 A和Ea分别为Arrennius常数和活化能 R和T分别为通用气体常数和绝对温度 Arrennius方程式 温度对比生长速率与比死亡速率的影响 微生物生长活化能Ea在50 70kJ mol 死亡活化能Ea 为300 380kJ mol 这说明死亡速率随温度增加的速度远大于生长速率 Kr1 Kr2分别为在温度T1 T2下酶的活力 活化能高低的意义 活化能E反映酶反应速率受温度变化的影响程度 例如 青霉菌生长的E 34kJ mol 青霉素合成的E 112kJ mol 说明 青霉素合成速率对温度特别敏感 细胞得率随温度升高而降低 原因是维持生命活动的能量需求增加 维持系数的活化能为50 70kJ mol 最大的转化率所处的温度一般略低于最适生长温度 温度对细胞得率的影响 1 温度对生长和生产的影响是不同的 温度升高 生长代谢加快 生产期提前 但酶因过热而失活 菌体易衰老 发酵周期缩短 影响产量 温度对发酵的影响 2 温度通过改变发酵液物理性质间接影响产物合成 氧的溶解度和基质的传质速率以及菌对养分的分解和吸收速率受温度影响 3 温度影响生物合成的方向 四环素发酵中金色链霉菌低于30 下 合成金霉素的能力较强 合成四环素的比例随温度升高而增大 35 只产生四环素 4 温度对代谢有调节作用20 氨基酸合成途径的反馈抑制作用比在37 大 故可考虑在抗生素发酵后期降低温度 让蛋白质和核酸的正常合成途径关闭得早 使发酵代谢转向产物合成 菌生长的最适温度与产物合成最适温度不一定一致 因此发酵过程应该变温控制 最适温度的选择 例1 黄原胶发酵前期生长温度控制27 中后期在32 可明显提高产胶量约20 例2 四环素发酵的温度控制 0 30h 稍高温度促进生长 缩短发酵周期 30 150h稍低温度维持较长生产期 例3 青霉素发酵的变温控制 0 5h 30 5 40h 25 40 125h 20 125 165h 25 供氧条件差的情况下 最适发酵温度比在正常情况低一些 这是由于低温下氧溶解度大 菌生长速率小一些 从而弥补因供氧不足而造成的代谢异常 温度选择应参考其他发酵条件 灵活掌握 培养基的成分和浓度 稀薄或较易利用的培养基时提高发酵温度则养分过早耗竭 导致菌丝过早自溶 产量降低 pH是微生物生长和产物合成非常重要的状态参数 是代谢活动的综合指标 因此 必须掌握发酵过程中pH变化的规律 及时监控 使它处于生产的最佳状态 7 3 5 pH的影响 大多数微生物生长适应的pH跨度为3 4 其最佳生长pH跨度为0 5 1 pH影响跨膜pH梯度 从而影响膜的通透性 发酵过程中pH变化的规律 1 生长最适温度高的菌种 其最适pH也相应高一些 设计微生物生长环境 如控制杂菌生长 2 微生物生长和产物合成阶段最适pH通常不一样 培养基成分 NH4 被利用成为R NH3 后 在培养基内生成H N03 还原为R NH3 氨基酸被利用后产生H 使pH下降 产物 有机酸 的积累 如乳酸 丙酮酸或乙酸 为什么发酵过程pH发生变化呢 pH的变化会影响各种酶活 菌对基质的利用速率和细胞的结构 从而影响菌的生长和产物的合成 变化的pH为什么影响细胞生长和产物合成呢 pH值还会影响菌体细胞膜电荷状况 引起膜渗透性的变化 从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分泌 准则 获得最大比生产速率和适当的菌量 以获得最高产量 最适pH的选择 举例 利福霉素生产的pH控制 pH7 0时 平均得率系数达最大值 故 生长期和生产期的pH分别维持在6 5和7 0可使利福霉素B的产率比整个发酵过程的pH维持在7 0的情况下的产率提高14 pH的控制 首先从基础培养基的配方考虑 然后通过加酸碱或中间补料来控制 如在基础培养基中加适量的CaCO3 常用NaOH或Ca OH 2调节pH 也需注意培养基离子强度和产物可溶性 链霉素的发酵 采用过程通NH3控制pH 也补充了N源 但在通氨过程中监测溶氧浓度的变化防止菌中毒 青霉素发酵中pH的控制 调节加糖速率来控制pH 比用恒速加糖 pH由酸碱控制可提高青霉素的产量25 在培养液的缓冲能力不强的情况下pH变化可反映菌的生理状况 例如 pH上升超过最适值 意味着菌处在饥饿状态 可加糖调节 加糖过量又会使pH下降 7 3 6 溶氧对发酵过程的影响 原因 氧的溶解度很低 28 氧在发酵液中100 的空气饱和浓度只有7mg L左右 比糖的溶解度小7000倍 在对数期即使发酵液中的溶氧能达到100 空气饱和度 若此时中止供氧 发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭 使溶氧成为限制因素 发酵过程中溶氧往往最易成为限制因素 溶氧的高低取决于供氧 通气搅拌等 还取决于需氧状况 最简便有效的办法是就地监测发酵液中的溶氧浓度 从溶氧变化的情况了解氧供需规律及其对生长和产物合成的影响 溶氧是否充足的判断 一 描述微生物需氧的物理量 比耗氧速度或呼吸强度 QO2 单位时间内单位重量的细胞所消耗的氧气 mmolO2 g菌 1 h 1 摄氧率 r 单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量 mmolO2 L 1 h 1 r QO2 X 微生物对氧的需求 空气饱和度百分数 发酵行业采用此方法表征溶氧 这只能在相似的温度 罐压 通气搅拌下进行比较 能反映菌的生理代谢变化和对产物合成的影响 应用时 必须在接种前标定电极 方法是在一定的温度 罐压和通气搅拌下以消后培养基被空气100 饱和为基准 二 溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响 CCr 临界溶氧浓度 指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度 一般对于微生物 CCr 1 15 饱和浓度 例 酵母4 6 10 3mmol L 1 1 8 产黄青霉2 2 10 2mmol L 1 8 8 定义 氧饱和度 发酵液中氧的浓度 临界溶氧溶度 所以对于微生物生长 只要控制发酵过程中氧饱和度 1 各种微生物的临界氧值以空气氧饱和度表示 细菌和酵母为3 10 放线菌为5 30 和霉菌为10 15 呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同 卷须霉素和头孢菌素的呼吸临界氧值分别13 23 和5 7 其抗生素合成的临界氧值则分别为8 和10 20 生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度 培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌的生长状况 二次生长 生长衰退或自溶时会出现溶氧 发酵过程中溶氧浓度的变化 即使是专性好气菌 过高的溶氧对生长可能不利 原因 氧的有害作用是通过形成新生O 超氧化物基02 和过氧化物基022 或羟基自由基OH 破坏许多细胞组分体现的 有些带巯基的酶对高浓度的氧敏感 培养过程中并不是维持溶氧越高越好 1 有些操作故障或事故引起的发酵异常现象能从溶氧的变化中得到反映 例1 停搅拌 未及时开搅拌或搅拌发生故障 空气未能与液体充分混合均匀等都会使溶氧比平常低许多 三 溶氧作为发酵异常的指示 2 中间补料是否得当可以从溶氧的变化看出 例如 赤霉素发酵 有时会出现 发酸 现象 这时 氨基氮迅速上升 溶氧会很快升高 这是由于供氧条件不强的情况下补料时机掌握不当和间隔过密 导致长时间溶氧处于较低水平所致 溶氧不足的结果 产生乙醇 并与代谢中的有机酸反应 形成一种带有酒香味的酯类 视为 发酸 3 污染杂菌遇到这种情况溶氧会一反往常迅速 一般2 5h内 跌到零 并长时间不回升 但不是一染菌溶氧就掉到零 要看杂菌的好气情况和数量 在罐内与生产菌比 看谁占优势 有时染菌后溶氧反而升高 原因 生产菌受到杂菌抑制 而杂菌又不太需氧 4 作为质量控制的指标例 天冬氨酸发酵 前期好气培养 后期转为厌气培养 酶活大为提高 掌握转换时机颇为关键 当溶氧下降到45 时由好气切换到厌氧可提高酶活6倍 供氧方面 dc dt KLa c cL 7 35 dc dt为单位时间内发酵液溶氧浓度的变化 mmol02 L h KL为氧传质系数 m h a为比界面面积 m2 m3 c 为氧在水中的饱和浓度 mmol L cL为发酵液中的溶氧浓度 mmol L 四 供氧的调节 凡是使KLa和c 增加的因素都能使发酵供氧改善 提高氧分压 在通气中掺入纯氧或富氧 提高罐压 但同时也会增加溶解C02的浓度 因它的溶解度比氧高30倍 这会影响pH和菌的生理代谢 还会增加对设备强度的要求 增加c 的办法 改变通气速率 作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分 在通气量较小的情况下增加空气流量 溶氧提高的效果显著 但在流量较大的情况下再提高空气流速 对氧溶解度的提高不明显 反而会使泡沫大量增加 引起逃液 理论上分析 KLa n d 通气量 提高搅拌 调节kla的效果显著 例黑曲霉生产糖化酶n230230270通气比1 0 81 1 21 0 8产量181224162846 调节Kla是最常用的方法 kla反映了设备的供氧能力 实际上 对于转速的调节有时是有限度的 通风的增加也是有限的 蒸发量大 中间挥发性代谢产物带走 小型发酵罐和大型发酵罐调节kla的特点 小型发酵罐 转速可调 大型发酵罐 转速往往不可调 措施 控制加糖或补料速率 改变发酵温度 液化培养基 中间补水 添加表面活性剂等 只要这些措施运用得当 便能改善溶氧状况和维持合适的溶氧水平 为改善溶氧状况 维持合适的溶氧水平还需要适当控制菌的摄氧率 影响需氧的工艺条件 培养基养分的丰富程度的影响限制养分的供给可减少菌的生长速率 也可达到限制菌对氧的大量消耗 从而提高溶氧水平 这看来有些 消极 但从总的经济情况看 在设备供氧条件不理想的情况下 控制菌量 使发酵液的溶氧不低于临界氧值 从而提高菌的生产能力 达到高产目标 温度的影响由于氧传质的温度系数比生长速率的低 降低发酵温度可得到较高的溶氧值 这是由于c 的增加 使供氧方程的推动力 c cL 增强 和影响了菌的呼吸 指偏离最适生长温度的情况下 据此 采用降温办法以提高溶氧的前提是对产物合成没有副作用 富氧气体既费事又不经济氧气的成本高 但对产值高的品种 规模较小发酵 在关键时刻 即菌的摄氧率达高峰阶段 采用富氧气体以改善供氧状况是可取的 这应当是改善供氧措施中的最后一招 纯氧与空气混合后使用较为安全 溶氧对发酵过程的影响还必须与其他参数配合起来分析 例如 搅拌对溶氧和菌的呼吸有较大的影响 但分析时还要考虑到它对菌丝形态 泡沫的形成 CO2的排除等其他因素的影响 7 3 7 二氧化碳和呼吸商 1 CO2可作为重要的基质 例1 精氨酸的合成过程中其前体氨甲酰磷酸的合成需要CO2 例2 无机化能营养菌能以CO2作为唯一碳源 例3 异养菌在需要时可利用补给反应来固定CO2 细胞本身的代谢途径通常能满足这一需要 如发酵前期大量通气 可能出现CO2受限制 导致适应 停滞 期的延长 CO2对发酵的影响 例1 尾气CO2浓度高于4 时 微生物的糖代谢与呼吸速率下降 当CO2分压为0 08 105Pa时 青霉素比合成速率降低40 例2 发酵液中溶解CO2浓度为1 6 10 2mol L时会强烈抑制酵母的生长 当进气CO2含量占混合气体流量的80 时酵母活力只有对照值的80 2 发酵液中CO2浓度对发酵有抑制或刺激作用 大多数微生物适应低CO2浓度 0 02 0 04 体积分数 溶解CO2主要作用于细胞膜的脂肪酸核心部位 而HCO3 则影响磷脂亲水头部带电荷表面及细胞膜表面的蛋白质 当细胞膜的脂质相中CO2浓度达到一临界值时 膜的流动性及表面电荷密度发生变化 将影响细胞膜的运输效率 使细胞处于 麻醉 状态 生长受抑制 形态发生变化 3 CO2对细胞的作用是影响细胞膜的结构 在10m高的罐中 在1 01 105Pa的气压下操作 底部的CO2分压是顶部的两倍 泡沫上升时 有时采用减少通气量 提高罐压来抑制逃液 这将增加CO2的溶解度 对菌的生长有害 4 工业发酵罐中CO2的影响值得注意 因罐内的CO2分压是液体深度的函数 呼吸商与发酵的关系 发酵过程中的摄氧率 OUR 和CO2的释放率 CER 发酵尾气O2含量的变化恰与CO2含量变化成反向同步关系 由此可判断菌的生长 呼吸情况 呼吸商 RQ CER OUR 呼吸商RQ RQ值可以反映菌的代谢情况 例如 酵母培养过程中 RQ 1 表示糖代谢走有氧分解代谢途径 仅供生长 无产物形成 RQ 1 1 表示走EMP途径 生成乙醇 RQ 0 93 生成柠檬酸 菌在利用不同基质时 其RQ值也不同 在青霉素发酵中生长 维持和产物形成阶段的理论RQ值分别为0 909 1 0和4 0 产物形成对RQ的影响较明显 如产物的还原性比基质大时 其RQ值就增加 反之 当产物的氧化性比基质大时 其RQ值就要减小 其偏离程度取决于单位菌体利用基质形成产物的量 不同发酵阶段的RQ值也不一样 原因 这说明发酵过程中存在着 不完全氧化的中间代谢物 葡萄糖以外的碳源 在实际生产中测得的RQ值明显低于理论值 加糖 补料对发酵的影响及其控制 分批发酵常因配方中的糖量过多造成细胞生长过旺 供氧不足 解决这个问题可在过程中加糖和补料 补料的作用 及时供给菌合成产物的需要 通过补料控制可调节菌的呼吸 以免过程受氧的限制 补料 分批培养也可用于研究微生物的动力学 比连续培养更易操作和更为精确 补料的策略 一次性大量 多次少量 连续流加 连续流加分为 快速 恒速 指数和变速流加 从补加的培养基成分来分 有用单一成分的 也有用多组分的料液 优化补料速率要根据微生物对养分的消耗速率及所设定的发酵液中最低维持浓度而定 不论生物反应器的体积传质系数大小 它们均有一最佳补料速率 补糖速率的最佳点与KLa有关 补料速率 设备供氧能力 KLa大 400h 1 补糖速率也需相应加大 结果生产水平也会相应提高 供氧能力差的设备 其补料速率也相应减小 才能达到这一设备的最高生产水平 补料的依据和判断 补料的判断依据 菌的形态 发酵液中糖浓度 溶氧浓度 尾气中的氧和CO2含量 摄氧率或呼吸商的变化等 例1 Waki等在补料分批发酵中通过监控CO2的生成来控制Trichodermareesei的纤维素酶的生产 例2 以发酵液中的残糖浓度为指标控制补料 对次级代谢产物的发酵 还原糖浓度一般控制在5g L左右的水平 例3 也有用产物的形