化学微生物学第5章生长与控制.ppt

第五章微生物生长与控制 生长 微生物细胞吸收营养物质 进行新陈代谢 当同化作用 异化作用时 生命个体的重量和体积不断增大的过程 繁殖 生命个体生长到一定阶段 通过特定方式产生新的生命个体 即引起生命个体数量增加的生物学过程 发育 从生长到繁殖 是生物的构造和机能从简单到复杂 从量变到质变的发展变化过程 这一过程称为发育 个体生长 微生物细胞个体吸收营养物质 进行新陈代谢 原生质与细胞组分的增加为个体生长 群体生长 群体中个体数目的增加 可以用重量 体积 密度或浓度来衡量 由于微生物的个体极小 所以常用群体生长来反映个体生长的状况 个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长 个体繁殖 生长与繁殖的概念 第五章微生物的生长与控制 第一节微生物纯培养分离及生长测定第二节微生物的生长规律第三节影响微生物生长的主要因素第四节微生物生长繁殖的控制 第一节微生物纯培养分离及生长测定 一 获得纯培养的方法 纯培养 pureculture 微生物学中把在实验室条件下从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代 称纯培养 单细胞 细菌 酵母菌等多细胞 丝状真菌 首先将待分离的样品进行连续稀释 目的是得到高度稀释的效果 使一支试管中分配不到一个微生物 如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长 那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物 这种方法适合于细胞较大的微生物 液体稀释法 平板划线分离法 StreakPlate 特点 快速 方便 分区划线 适用于浓度较大的样品 连续划线 适用于浓度较小的样品 Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar 连续划线 左图 划线分离后平板上显示的菌落照片 右图 倾注平板法 PourPlate Organismsareseriallydiluted thenasmallamountisaddedtoanemptysterilepetridish towhichmeltedagarat50 Cisadded Thenmixtodistributetheorganisms 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml Pourplate Pourplate Pourplate Pourplate 平板涂布分离法 SpreadPlate 简单易行 但易造成机械损伤 Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod 选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物 可以根据该微生物的特点 包括营养 生理 生长条件等 采用选择培养的方法进行分离 利用选择培养基进行直接分离 富集培养 单细胞 单孢子 分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法 该方法要在显微镜下进行 毛细管法 用毛细管提取微生物个体 适合于较大微生物 显微操作仪 用显微针 钩 环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养 小液滴法 将经过适当稀释后的样品制成小液滴 在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离 二 微生物纯培养生长的测定方法 描述不同种类 不同生长状态的微生物生长情况 需选用不同的测定指标 一 微生物细胞数目的检测法直接法 血球计数板 比例计数法 间接法 活菌计数法 液体稀释法 膜过滤法 二 微生物生长量和生理指标测定法直接法 干重法 堆体积法 间接法 比浊法 碳 氮含量法 其它生理指标 1 血球计数板法 原理 将1mm2 0 1mm的薄层空间划分为400小格 从中均匀分布地选取80或100小格 计数其中的细胞数目 换算成单位体积中的细胞数 适用范围 个体较大细胞或颗粒 如血球 酵母菌等 不适用于细菌等个体较小的细胞 因为 1 细菌细胞太小 不易沉降 2 在油镜下看不清网格线 超出油镜工作距离 特点 快速 准确 对酵母菌可同时测定出芽率 或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞 血球计数板法原理 2 涂片染色法 应用 可同时计数不同微生物的菌数 适于土壤 牛奶中细菌计数 方法 用镜台测微尺计算出视野面积 取0 1ml菌液涂于1cm2面积上 计数后代入公式 每ml原菌液含菌数 视野中平均菌数 涂布面积 视野面积 100 稀释倍数 3 平板菌落计数法 平板菌落计数法技术要求 技术要求 样品充分混匀 操作熟练快速 15 20min完成操作 严格无菌操作 注意事项 每一支吸管只能用于一个稀释度 样品混匀处理 倾注平板时的培养基温度 适用范围 中温 好氧和兼性厌氧 能在营养琼脂上生长的微生物 误差 多次稀释造成的误差是主要来源 其次还有由于样品内菌体分布不均匀 以及不当操作 Astandardplatecount viablecount reflectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony platecountsarereportedasnumberofcolony formingunits CFU perml CFU ml orperg CFU g ofsample Whenweobservecolonies wecannotassumeeacharosefromjustonecelloriginallyplantedonthemedium however Apair chainorclusterofcellswhich land onthemediumincloseproximitytoeachothercanmultiplyandproduceasinglecolony Thus weusethetermcolony formingunitwhenweconsiderthecommonoriginforthecellsofanycolony ThistermisusuallyabbreviatedCFU Colony FormingUnit 4 液体稀释法 10n 10n 2 10n 1 5 薄膜过滤计数法 常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目 将定量的样品通过薄膜 硝化纤维素薄膜 醋酸纤维薄膜 过滤 菌体被阻留在滤膜上 取下滤膜进行培养 然后计算菌落数 可求出样品中所含菌数 6 干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来 然后烘干 干燥温度可采用105 100 或80 称重 一般干重为湿重的10 20 而一个细菌细胞一般重约10 12 10 13g 该法适合菌浓较高的样品 举例 大肠杆菌一个细胞一般重约10 12 10 13g 液体培养物中细胞浓度达到2 109个 ml时 100ml培养物可得10 90mg干重的细胞 7 比浊法 原理是在一定范围内 菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比 即与光密度成正比 菌数越多 光密度越大 因此 借助于分光光度计 在一定波长下测定菌悬液的光密度 就可反应出菌液的浓度 特点 快速 简便 但易受干扰 8 生理指标法 测含氮量蛋白质是细胞的主要物质 含量稳定 而氮是蛋白质的主要成分 通过测含氮量就可推知微生物的浓度 一般细菌含氮量为干重的12 5 酵母菌为7 5 霉菌为6 0 根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6 25 就可测得粗蛋白的含量 其他方法含碳 磷 DNA RNA 耗氧量 消耗底物量 产二氧化碳 产酸 产热 粘度等 都可用于生长量的测定 Table1 SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowth 第二节微生物的生长规律 一 微生物的个体生长和同步生长 由于微生物细胞极其微小 研究其个体生长存在着技术上的困难 同步生长的概念 一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态 称为同步生长 synchronousgrowth 进行同步分裂的细胞称为同步细胞 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相 彼此间形态 生化特征都很一致 因而是细胞学 生理学和生物化学等研究的良好材料 获得同步生长的方法 获得同步生长的方法主要有两类 环境条件诱导法 变换温度 光线 培养基等 造成与正常细胞周期不同的周期变化 选择法 选择性过滤 梯度离心 物理方法 随机选择 不影响细胞代谢 Helmstetter Cummings法 原理 一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上 步骤 菌悬液通过微孔滤膜 细胞吸附其上 反置滤膜 以新鲜培养液通过滤膜 洗掉浮游细胞 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞 即为同步培养 Figure5 Thesynchronousgrowthofabacterialpopulation Bycarefulselectionofcellsthathavejustdivided abacterialpopulationcanbesynchronizedinthebacterialcelldivisioncycle Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations Figure synchronousgrowth 二 微生物的群体生长 无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代 一个世代所需的时间就是代时 enerationtime G 代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间 有时也称为倍增时间 右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况 右图可见 每经过一个代时 细胞数目就增加一倍 呈指数增加 因而被称为指数生长 这就是单细胞群体生长的特征 1 无分支单细胞微生物的群体生长特征 Bydefinition bacterialgrowthiscellreplication i e growthoftheculture Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission whereonecelldividesinto2cells the2cellsinto4 the4into8 etc Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions wecanplotnumbersofcellsvs timesuchasonthegraphatright Beforetoolong wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble Foraculturewherecellsdivideevery20minutes onecellcanresultin16 777 216 i e 224 cellsafterjust8hours barringnutrientdepletionorothergrowth alteringconditions 1 无分支单细胞微生物的群体生长特征 Ifweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale asonthegraphatright wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline Ontheverticalaxis thesamedistanceonthepaperiscoveredwitheachdoubling Thistypeofgraphpaperiscalledsemilogarithmicgraphpaperonwhichwewillbeplottingourclassresults Thenumbersweplotwillfallonthegraphatthesameplacethelogarithmsofthesenumberswouldfallwhenplottedonconventionalgraphpaper Theexampleatrightshowsthetypeofgraphwemayobtainfromourclassdata Wecanplotbothcolony formingunits CFUs permlandabsorbanceonthesamegraph rememberingthattheabsorbanceunitsshouldalsobeonalogarithmicscale Ratherthan connectingthedots wedrawthebeststraightlineamongourCFU mlplotstorepresentthephasesofgrowth lag exponential andthestartofthemaximumstationaryphase 指数生长可以用下式表示 b B 2nB b和t可由试验获得 n可通过上式计算得出 将等式两侧取对数重排后得 lgb lgB nlg2lgb lgBlgb lgBlg20 301 式中 B为起始时细胞数目 b为指数生长某个时刻t时的细胞数目 n为世代数 指数生长 n 例如 一培养液中微生物数目由开始的12 000 B 经4h t 后增加到49 000 000 b 这样 n lg4 9 107 lg1 2 104 0 301 12 借助于n和t 还可以计算出不同培养条件下的代时G G t n在本例中 G 4 60 12 20min 该种微生物的代时为20分钟 在4小时内共繁殖了12代 代时能够反应细菌的生长速率 代时短 生长速率快 代时长 生长速率慢 在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时 代时在不同种微生物中的变化很大 多数微生物的代时为1 3h 然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min 而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天 另外 同一种微生物 在不同的生长条件下其代时的长短也不同 但是 在一定条件下 每一种微生物的代时是恒定的 因此它是微生物菌种的一个重要特征 一些细菌的代时 Table Generationtimesforsomecommonbacteriaunderoptimalconditionsofgrowth 不同温度下的代时 G generationtime t time inminutesorhours n numberofgenerations G t nG generationtime timeforthecellstodivide t timeintervalinhoursorminutesB numberofbacteriaatthebeginningofatimeintervalb numberofbacteriaattheendofthetimeintervaln numberofgenerations numberoftimesthecellpopulationdoublesduringthetimeinterval b Bx2n Thisequationisanexpressionofgrowthbybinaryfission G t n Solveforn n logB nlog2n logb logBlog2n logb logB 301n 3 3logb BG t nSolveforGG t3 3logb B CalculationofGenerationTime Example Whatisthegenerationtimeofabacterialpopulationthatincreasesfrom10 000cellsto10 000 000cellsinfourhoursofgrowth G t3 3logb BG 240minutes3 3log107 104G 240minutes3 3x3G 24minutes 2 无分支单细胞微生物的群体生长曲线 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律 其结论也基本适用于酵母菌 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长 分裂直至死亡的整个动态变化过程 每种细菌都有各自的典型生长曲线 但它们的生长过程却有着共同的规律性 一般可以将生长曲线划分为四个时期 将少量单细胞的纯培养 接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中 在适宜条件下培养 每隔一定时间取样 测菌细胞数目 以培养时间为横坐标 以细菌增长数目的对数为纵坐标 绘制所得的曲线 生长曲线的制作 典型的生长曲线 Growthcurve 延滞期 对数期 稳定期 衰亡期 时期的划分 按照生长速率常数 growthraceconstant 不同 一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期 对数期 稳定期和衰亡期等四个生长时期 其它名称 停滞期 调整期 适应期1 现象 活菌数没增加 曲线平行于横轴 2 特点 生长速率常数 0细胞形态变大或增长细胞内RNA特别是rRNA含量增高 原生质嗜碱性增强合成代谢活跃 核糖体 酶类 ATP合成加快 易产生诱导酶对外界不良条件敏感 如氯化钠浓度 温度 抗生素等化学药物 3 原因 适应新的环境条件 合成新的酶 积累必要的中间产物 延滞期 lagphase 菌种 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短 接种物菌龄 用对数生长期的菌种接种时 其延迟期较短 甚至检查不到延迟期 接种量 一般来说 接种量增大可缩短甚至消除延迟期 发酵工业上一般采用1 10的接种量 培养基成分 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短 接种后培养基成分有较大变化时 会使延滞期加长 所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近 影响延迟期长短的因素 认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义 在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期采取的缩短lagphase的措施有 增加接种量 群体优势 适应性增强 采用对数生长期的健壮菌种 调整培养基的成分 在种子基中加入发酵培养基的某些成分 选用繁殖快的菌种 在食品工业上 尽量在此期进行消毒或灭菌 对数期 logarithmicphase 其他名称 指数期现象 细胞数目以几何级数增加 其对数与时间呈直线关系 特点 生长速率常数最大 即代时最短细胞进行平衡生长 菌体大小 形态 生理特征等比较一致代谢最旺盛细胞对理化因素较敏感影响因素 菌种营养成分营养物浓度 培养温度 应用意义 由于此时期的菌种比较健壮 增殖噬菌体的最适菌龄 生产上用作接种的最佳菌龄 发酵工业上尽量延长该期 以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色 形态观察等的良好材料 营养物浓度与对数期生长速率和产量 作用方式 影响微生物的生长速率和总生长量生长限制因子 凡是处于较低浓度范围内 可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子 细胞数或菌体量 稳定期 stationaryphase 又称 恒定期或最高生长期特点 新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等 微生物的生长速率处于动态平衡 培养物中的细胞数目达到最高值 细胞分裂速度下降 开始积累内含物 产芽孢的细菌开始产芽孢 此时期的微生物开始合成次生代谢产物 对于发酵生产来说 一般在稳定期的后期产物积累达到高峰 是最佳的收获时期 产生原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽营养物的比例失调 如碳氮比不合适 有害代谢废物的积累 酸 醇 毒素等 物化条件 pH 氧化还原势等 不合适 应用意义 1 发酵生产形成的重要时期 抗生素 氨基酸等 生产上应尽量延长此期 提高产量 措施如下 补充营养物质 补料 调pH调整温度2 稳定期细胞数目及产物积累达到最高 生长产量常数 Y 或生长得率 growthyield 概念 表示微生物对基质利用效率的高低Y 菌体干重 消耗营养物质的浓度根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量如 Y 0 5 表示要得到5g菌体 需某营养物 葡萄糖 10g 衰亡期 declinephase 特点 细胞死亡数增加 死亡数大大超过新增殖的细胞数 群体中的活菌数目急剧下降 出现 负生长 细胞内颗粒更明显 细胞出现多形态 畸形或衰退形 芽孢开始释放 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用 使菌体死亡 自溶等 发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势 衰亡期比其他各时期时间长 它的长短也与菌种和环境条件有关 产生原因生长条件的进一步恶化 使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢 继而导致菌体的死亡 3 微生物生长与代谢产物形成的关系 微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的 一般认为 初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程 初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步 微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机 次级代谢产物与微生物的生存 生长和繁殖无关 次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步 在分批培养中 它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期 4 丝状微生物的群体生长 丝状微生物的纯培养采用孢子接种 在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养 菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构 可以用菌丝干重作为衡量生长的指标 即以时间为横坐标 以菌丝干重为纵坐标 绘制生长曲线 可分为三个阶段 1 生长停滞期2 迅速生长期3 衰退期 1 生长停滞期 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态 另一种是生长已经开始 但还无法测定 2 迅速生长期 菌丝体干重迅速增加 其立方根与时间呈直线关系 菌丝干重不以几何级数增加 没有对数生长期 生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支 断裂等 此时期的菌体呼吸强度达到高峰 有的开始积累代谢产物 3 衰退期 菌丝体干重下降 到一定时期不再变化 大多数次级代谢产物在此期合成 大多数细胞都出现大的空泡 有些菌丝体还会发生自溶菌丝体 这与菌种和培养条件有关 丝状微生物的群体生长分期 连续培养 continuousculture 分批培养 batchculture 将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养 培养基一次性加入 不再补充和更换 最后一次性收获 连续培养 continuousculture 在微生物培养的过程中 不断地供给新鲜的营养物质 同时排除含菌体及代谢产物的发酵液 让培养的微生物长时间地处于对数生长期 以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态 连续培养理论基础 由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识 采取相应有效措施推迟其来临 从而发展出现在的连续培养技术 原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌 另一方面以溢流方式流出培养液 使培养物达到动态平衡 其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率 连续培养原理 按控制方式分按培养器的级数分按细胞状态分按用途分 内控制 控制菌体密度 恒浊器外控制 控制培养液流速 以控制生长速率 恒化器 单级连续培养器多级连续培养器 一般连续培养器固定化细胞连续培养器 实验室科研用 连续培养器发酵生产用 连续发酵罐 连续培养器 连续培养技术 恒化连续培养 概念 以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法 原理 通过控制某一种营养物浓度 如碳 氮源 生长因子等 使其始终成为生长限制因子 而达到控制培养液流速保持不变 并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖 特点 维持营养成分的亚适量 控制微生物生长速率 菌体生长速率恒定 菌体均一 密度稳定 产量低于最高菌体产量 应用范围 实验室科学研究 Figure Schematicdiagramofachemostat adeviceforthecontinuouscultureofbacteria Thechemostatrelievestheenvironmentalconditionsthatrestrictgrowthbycontinuouslysupplyingnutrientstocellsandremovingwastesubstancesandspentcellsfromtheculturemedium 恒化器Chemostat或bactogen 概念 通过调节培养基流速 使培养液浊度保持恒定的连续培养方法 原理 通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变 即浊度不变 主要采用恒浊器 当浊度高时 使新鲜培养基的流速加快 浊度降低 则减慢培养基的流速 特点 基质过量 微生物始终以最高速率进行生长 并可在允许范围内控制不同的菌体密度 但工艺复杂 烦琐 连续培养技术 恒浊培养 使用范围 用于生产大量菌体 生产与菌体生长相平行的某些代谢产物 如乳酸 乙醇等 恒浊器与恒化器的比较 连续发酵 continuousfermentation 连续培养在生产上的应用 相对于单批发酵而言 优点 高效 简化了操作 装料 灭菌 出料 清洗发酵罐等单元操作 自控 便于利用各种仪表进行自动控制 产品质量稳定节约大量动力 人力 水和蒸汽 且使水 汽 电的负荷均衡合理 缺点 菌种易于退化 易于遭到杂菌污染 营养物利用率低于单批培养 连续发酵的生产时间受以上因素限制 一般只能维持数月 1年 微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用 一方面 各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响 另一方面 微生物生长繁殖也会影响和改变环境 研究环境因素与微生物之间的关系 可以通过控制环境条件来利用微生物有益的一面 同时防止它有害的一面 第三节影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的外界因素很多 除了前面讲过的营养因素之外 还有许多物理化学条件 本节主要内容 一 温度对微生物生长的影响二 氧气对微生物生长的影响三 pH值对微生物生长的影响 几个基本概念 灭菌 sterilization 采用强烈的理化因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施 称为灭菌 消毒 disinfection 采用较温和的理化因素 仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌 而对被处理物体基本无害的措施 称为消毒 防腐 antisepsis 利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖 从而达到防止物品发生霉腐的措施 称为防腐 化疗 chemotheraphy 即化学治疗 利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖 以达到治疗该传染病的一种措施 低温利用4 以下的各种低温以保藏食物 药品 菌种等 缺氧在密闭容器中加入除氧剂 如铁粉 真空保藏也是比较常用的方法 干燥采用晒干或红外线干燥保藏粮食 食品等 或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用 高渗 通过盐渍或糖渍达到高渗 高酸度 如泡菜 酸菜等 防腐剂 苯甲酸 山梨酸 脱氢醋酸等 防腐的措施 温度是影响微生物生长的最重要因素之一 温度对微生物的影响具体表现在 影响酶活性 温度变化影响酶促反应速率 最终影响细胞合成 影响细胞膜的流动性 温度高 流动性大 有利于物质的运输 温度低 流动性降低 不利于物质运输 因此 温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌 影响物质的溶解度 对生长有影响 一 温度对微生物生长的影响 从微生物整体来看生长的温度范围一般在 10 100 极端下限为 30 极端上限为105 300 但对于特定的某一种微生物 只能在一定温度范围内生长 在这个范围内 每种微生物都有自己的生长温度三基点 即最低 最适 最高生长温度 超过最低生长温度时 微生物不生长 温度过低 甚至会死亡 处于最适生长温度时 生长速度最快 代时最短 超过最高生长温度时 微生物不生长 温度过高 甚至会死亡 一 微生物生长的三个温度基点 二 微生物生长温度类型 低温型微生物 嗜冷微生物 中温型微生物 嗜温微生物 高温型微生物 嗜热微生物 低温型微生物最适生长温度在5 20 主要分布在地球的两极 冷泉 深海 冷冻场所及冷藏食品中 例 假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长 常引起冷藏食品的腐败 嗜冷微生物在低温下生长的机理 目前还不清楚 据推测有两种原因 它们体内的酶能在低温下有效地催化 在高温下酶活丧失 细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高 低温下也能保持半流动状态 可以进行物质的传递 中温型微生物室温型主要为腐生或植物寄生 在植物或土壤中 最适生长温度为20 40 大多数微生物属此类 体温型主要为寄生 在人和动物体内 高温型微生物最适生长温度为50 60 主要分布在温泉 堆肥和土壤中 在高温下能生长的原因 酶蛋以及核糖体有较强的抗热性 核酸具有较高的热稳定性 核酸中G C含量高 tRNA 可提供形成氢键 增加热稳定性 细胞膜中饱和脂肪酸含量高 较高温度下能维持正常的液晶状态 高温微生物的特点生长速度快 合成大分子迅速 可及时修复高温对其造成的分子损伤 耐高温菌具应用优势在减少能源消耗 减少染菌 缩短发酵周期等方面具重要意义 不同生理生化过程的最适温度 微生物不同生理活动要求不同温度 所以 最适生长温度 发酵速度快 积累代谢产物多 以青霉素的生产为例 培养165小时采用分段控制温度的方法 其青霉素产量比始终在30 培养提高了14 7 分段控制方式 0 5小时 30 5 40小时 25 40 125小时 20 125 165小时 25 1 高温对微生物的影响高温下蛋白质不可逆变性 膜受热出现小孔 破坏细胞结构 溶菌 微生物对热的耐受力与以下因素有关 1 微生物种类及发育阶段嗜热菌比其它类型的菌体抗热有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强老龄菌比幼龄菌抗热 三 高温与低温对微生物的影响 2 微生物对热的耐受力还受环境条件影响与培养基的营养成分有关 培养基中蛋白质含量高时比较耐热 与pH有关 pH适宜时不易死亡 pH不适宜时 容易死亡 与水分有关 含水量大时容易死亡 含水量小时不容易死亡 与含菌量有关 含菌量高 抗热性增强 含菌量低 抗热性差 与热处理时间有关 热处理时间长 微生物易死亡 当环境温度低于微生物的最适生长温度时 微生物的生长繁殖停止 当微生物的原生质结构并未破坏时 不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力 当温度提高时 可以恢复正常的生命活动 低温保藏菌种就是利用这个原理 一些细菌 酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4 的冰箱中 当温度过低 造成微生物细胞冻结时 有的微生物会死亡 有些则并不死亡 2 低温对微生物的影响 造成死亡的原因 冻结时细胞水分变成冰晶 冰晶对细胞膜产生机械损伤 膜内物质外漏 冻结过程造成细胞脱水冻结速度对冰晶形成有很大影响 缓慢冻结 形成的冰晶大 对细胞损伤大 快速冻结 形成的冰晶小 分布均匀 对细胞的损伤小 因此 利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏 一般情况下在菌悬液中再加一些甘油 糖 牛奶 保护剂等可对菌种进行长期保藏 微生物对氧的需要和耐受力在不同的类群中变化很大 根据微生物与氧的关系 可把它们分为几种类群 专性好氧菌 好氧菌微好氧菌 兼性厌氧菌耐氧厌氧菌 厌氧菌 专性 厌氧菌 二 氧气对微生物生长的影响 氧浓度对不同微生物生长的影响 专性好氧菌 strictaerobe 必须在有分子氧的条件下才能生长 有完整的呼吸链 以分子氧作为最终氢受体 细胞含有超氧物歧化酶 SOD superoxidedismutase 和过氧化氢酶 在有氧或无氧条件下均能生长 但有氧情况下生长得更好 在有氧时靠呼吸产能 无氧时接发酵或无氧呼吸产能 细胞含有SOD和过氧化氢酶 微好氧菌 microaerophilicbacteria 只能较低的氧分压下才能正常生长 通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能 兼性好氧菌 facultativeaerobe 耐氧菌 aerotolerantanaerobe 可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌 生活不需要氧 分子氧也对它无毒害 不具有呼吸链 依靠专性发酵获得能量 细胞内存在SOD和过氧化物酶 但缺乏过氧化氢酶 厌氧菌 anaerobe 分子氧对它有毒害 短期接触空气 也会抑制其生长甚至致死 在空气或含有10 CO2的空气中 在固体培养基表面上不能生长 只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长 生命活动所需能量通过发酵 无氧呼吸 循环光合磷酸化或甲烷发酵提供 细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶 大多数还缺乏过氧化氢酶 严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死 而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡 在氧还原为水的过程中 可形成某些有毒的中间产物 例如 过氧化氢 H2O2 超氧阴离子 O2 等 超氧阴离子为活性氧 兼有分子和离子的性质 反应力极强 极不稳定 可破坏膜和重要生物大分子 对微生物造成毒害或致死 好氧微生物具有降解这些产物的酶 如过氧化氢酶 过氧化物酶 超氧化物歧化酶等 而严格厌氧菌缺乏SOD 故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死 厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说 各类菌所含对氧解毒酶 专性好氧菌SOD 过氧化氢酶兼性厌氧菌SOD 过氧化氢酶专性厌氧菌二种酶均无微好氧菌少量SOD耐氧菌SOD 过氧化物酶 H2O 1 2O22O2 2H O2 H2O22H2O O2 eO2 O2 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式 兼性厌氧菌E coli在发生SOD缺失突变后 就会变成一种 严格厌氧菌 生物体中超氧阴离子的形成与去除 SOD好氧生物和耐氧细菌 过氧化氢酶好氧生物 过氧化物酶NADH2NAD耐氧菌 在培养不同类型的微生物时 要采用相应的措施保证不同微生物的生长 培养好氧微生物 需震荡或通气 保证充足的氧气 培养专性厌氧微生物 需排除环境中的氧气 同时在培养基中添加还原剂 降低培养基中的氧化还原电位势 培养兼性厌氧或耐氧微生物 可深层静止培养 影响膜表面电荷的性质及膜的通透性 进而影响对物质的吸收能力 改变酶活 酶促反应的速率及代谢途径 如 酵母菌在pH4 5 5产乙醇 在pH6 5以上产甘油 酸 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度 从而影响营养物质吸收 或有毒物质的毒性 三 pH值与微生物生长的相互影响 一 环境pH值对微生物生长的影响 微生物的生长pH值范围极广 从pH8都有微生物能生长 但是绝大多数种类都生活在pH5 0 9 0之间 微生物生长的pH值三基点 各种微生物都有其生长的最低 最适和最高pH值 低于最低 或超过最高生长pH值时 微生物生长受抑制或导致死亡 不同的微生物最适生长的pH值不同 根据微生物生长的最适pH值 将微生物分为 嗜碱微生物 硝化细菌 尿素分解菌 多数放线菌耐碱微生物 许多链霉菌中性微生物 绝大多数细菌 一部分真菌嗜酸微生物 硫杆菌属耐酸微生物 乳酸杆菌 醋酸杆菌 二 不同微生物对pH要求不同 一些微生物生长的pH值范围 不同微生物的生长pH值范围 同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中 对pH值的要求也不同 在发酵工业中 控制pH值尤其重要 举例 Aspergillusniger在pH2 2 5范围时有利于合成柠檬酸 当在pH2 5 6 5范围内时以菌体生长为主 而在pH7 0时 则以合成草酸为主 丙酮丁醇梭菌在pH5 5 7 0范围时 以菌体生长为主 而在pH4 3 5 3范围内才进行丙酮丁醇发酵 生长的最适pH值与发酵的最适pH值 同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中 对环境pH值要求不同 例如 丙酮丁醇梭菌在pH值 5 5 7 0时 以菌体生长为主在pH值 4 3 5 3时 进行丙酮丁醇发酵同一种微生物由于环境pH值不同 可能积累不同的代谢产物 例如 黑曲霉pH值 2 3时 产物以柠檬酸为主 只产少量草酸 pH值在7左右时 产物以草酸为主 只产少量柠檬酸 三 微生物细胞内的pH值 虽然微生物生活的环境pH值范围较宽 但是其细胞内的pH值却相当稳定 一般都接近中性 这种维持细胞内稳定中性pH值的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值 微生物胞内酶的最适pH值一般为中性 胞外酶的最适pH值接近环境pH值 四 微生物的生命活动对环境pH值的影响 微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变 原因 由于有机物分解 分解糖类 脂肪等 产生酸性物质 使培养液pH值下降 分解蛋白质 尿素等 产生碱性物质 使培养液pH值上升由于无机盐选择性吸收 铵盐吸收 NH4 2SO4H2SO4 pH 硝酸盐吸收 NaNO3NaOH pH 培养过程中调节pH值的措施过酸时 加入碱或适量氮源 提高通气量 过碱时 加入酸或适量碳源 降低通气量 NH4 被吸收 NO3 被吸收 配制培养基时调整pH值的措施 五 酸碱添加剂的抑菌机理 酸类物质 无机酸 与H 浓度成正比的高氢离子浓度 可引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解 并破坏酶类的活性有机酸 与不电离的部分成正比 故有时有机酸的抑菌效果 无机酸 作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用 从而抑制微生物的生长 碱类物质 强碱可引起蛋白质 核酸大分子变性 水解 以杀死或抑制微生物 食品工业中常用石灰水 NaOH Na2CO3等作为机器 工具以及冷藏库的消毒剂 第四节微生物生长繁殖的控制 1 高温灭菌 消毒 法 是最常用的物理方法 高温可引起蛋白质 核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡 一 常用的灭菌 消毒 抑菌及除菌的物理方法 一 温度 干热灭菌法 dryheatsterilization 焚烧法 incineration 是将被灭菌物品在火焰中燃烧 使所有的生物质碳化 简单 彻底 但对被灭菌物品的破坏极大 适用于无经济价值的物品灭菌 及不怕烧的实验器具 如接种环 镊子 试管或三角瓶口的灭菌等 干燥热空气灭菌法 hot airoven 将物品放入烘箱内 然后升温至150 170 维持1 2小时 适用于玻璃 陶瓷和金属物品的灭菌 不适合液体样品 及棉花 纸张 纤维和橡胶类物质的灭菌 特点 由于空气传热穿透力差 菌体在脱水状态下不易杀死 所以温度高 时间长 湿热法 moistheatsterilization 特点 温度低 时间短 灭菌效果高原因 1 菌体内含水量越高 则凝固温度越低 2 蒸汽冷凝会放出潜热 3 饱和水蒸汽穿透力强 4 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定性 主要破坏氢键结构 高压蒸汽灭菌法利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升 以达到100 以上高温灭菌的方法 方法 121 1kg cm2或15磅 英寸2 维持15 20min 112 0 5kg cm2或8磅 英寸2 20 30min 115 0 75kg cm2或11磅 英寸2 20 30min 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度例如 生理盐水 营养琼脂等培养基用121 葡萄糖 乳糖 氨基酸等培养基用112 适用 耐高温物品 玻璃仪器 含水或不含水的物品 注意事项 排净冷空气 灭菌终了 缓慢降压 灭菌结束 趁热取出物品 高压蒸汽灭菌锅 高温对培养基的影响及其防止措施 高温对培养基的不利影响 会产生混浊或形成不溶性沉淀 营养成分被破坏 PO4 3存在 葡萄糖生成酮糖 菌不利用 色泽加深 褐变如产生氨基糖等 改变培养基的pH值 通常下降0 2 形成有害物质 抑制微生物生长 消除有害影响的措施采用特殊的加热灭菌法过滤除菌法加入螯合剂 煮沸消毒法将水加热至100 煮沸15min 30min 可杀死所有营养细胞和部分芽孢 达到消毒物的目的 巴斯德消毒法 Pasteurization 用较低的温度来杀死其中的病源微生物 这样既保持食品的营养风味 又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于62 处理30min 然后迅速冷却 即可达到消毒目的 低温长时法 Lowtemperaturelongtime LTLT 62 9 30min处理牛奶高温瞬时 Hightemperatureshorttime HTST 71 6 15s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法 Ultrapasteurization 让液体食品停留在140 左右3 4s 急剧冷却至75 经匀质化后冷却至20 间歇灭菌法 丁达尔灭菌法 将待灭菌物品在80 100 蒸煮15 60min 冷却后搁置室温 28 37 下过夜 并重复以上过程三遍以上 其蒸煮过程可杀死微生物的营养体 但不能杀死芽胞 室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体 再经蒸煮过程可杀死新的营养体 循环三次以上可保证彻底灭菌的目的 适用于不耐高温的物品灭菌 如不适于高压灭菌的特殊培养基 药品的灭菌 缺点是麻烦 费时 低温 低温是通过降低酶反应速度使微生物生长受到抑制 冷藏法 5 微生物斜面菌种放置冷藏箱中可保存数周至数月而不衰竭死亡 食品保鲜冷冻法 食品工业中采用 10 左右的冷冻温度较长时间地保藏食品 冷冻法也可用作菌种保藏 但所需温度更低 如 80 低温冰箱 或 78 干冰 或 80 液氮中冷冻保存 2 低温抑菌 采用滤孔比细菌还小的筛子或滤膜作成各种过滤器 当空气或液体流经筛子或滤膜时 微生物不能通过滤孔而被阻留在一侧 从而达到灭菌的目的 但不能除去病毒 实验室中常用的滤器 滤膜过滤器 蔡氏过滤器 玻璃过滤器 磁土过滤器等 过滤介质 醋酸纤维素膜 硝酸纤维素膜 聚丙烯膜 以及石棉板 烧结陶瓷 烧结玻璃等 滤器孔径 常用0 22 m 0 45 m 应用 对于含酶 血清 维生素和氨基酸等热敏物质除菌 二 过滤除菌法 二 常用的控菌方法 消毒剂 可以抑制或杀灭微生物 但对人体也可能产生有害作用的化学试剂 主要用于抑制或杀灭物体表面 器械 排泄物和环境中的微生物 防腐剂 可以抑制或阻止微生物生长 但对人体或动物体的毒性较低的化学药剂 用于肌体表面 如皮肤 粘膜 伤口等处防止感染 也有的用于食品 饮料药品的防腐作用 但现时消毒剂和防腐剂间的界限已并不很严格 消毒防腐剂的作用机理一般有下列三种方式 使微生物蛋白质凝固变性 发生沉淀 如酒精等 破坏菌体的酶系统 影响菌体代谢 如过氧化氢等 降低微生物表面张力 增加细胞膜的通透性 使细胞发生破裂或溶解 如来苏儿等酚类物质 一 消毒剂和防腐剂 常用的消毒防腐剂及其应用 常用的消毒防腐剂及其应用 常用的消毒防腐剂及其应用 常用消毒防腐剂机理 一 醇是脱水剂和脂溶剂 可使蛋白质脱水 变性 杀死菌体 还能溶解物品表面的油脂 所以有机械除菌的作用 乙醇是常用的消毒剂 70 重量 或77 体积 效果最好 纯乙醇不起杀菌作用 乙醇对芽孢不敏感 甲醇杀菌力差而且有毒 不宜作杀菌剂 醇的杀菌力随分子量的增加而增加 丁醇 丙醇 乙醇 甲醇 90 95 异丙醇比70 乙醇杀菌力大但有刺鼻气味 二 甲醛通常使用37 40 甲醛溶液 福尔马林 可杀死细菌 真菌及其芽孢和病毒 0 1 0 2 的甲醛溶液可杀死细菌营养体 5 可杀死芽孢 甲醛具有还原作用 能与蛋白质的 NH结合而使蛋白质变性 可作熏蒸消毒剂 对空气和物体表面消毒 也常用作动物组织的固定剂 三 表面活性剂1 酚酚是表面活性剂 可引起蛋白质变性 还可抑制脱氢酶和氧化酶的活性 又名石炭酸 常用浓度5 短时间内可杀死细菌营养体 杀死细菌芽孢需要几小时或更长的时间 酚的衍生物