外源化学物的一般毒性作用.ppt

第6章化学毒物的一般毒性作用 一般毒性作用 generaltoxicity 基础毒性 basictoxicity 指外来化学物在一定的剂量 一定接触时间和接触方式下对机体产生的综合毒效应 一般毒性作用根据接触时间的长短可分为急性毒性 亚慢性毒性和慢性毒性 相应的试验称急性毒性试验 亚慢性毒性试验和慢性毒性试验 1急性毒性作用2局部刺激试验 localirritationtest 3蓄积毒性作用及其评价4亚慢性和慢性毒性作用 2020 3 26 1 1急性毒性作用 新外源化合物首先需必须阐明其急性毒性的强度及特征 1 1基本概念1 2急性毒性试验的目的1 3急性毒性试验设计1 4急性毒性替代试验1 5LD50应用中的有关问题1 6急性毒性评价 2020 3 26 2 1 1基本概念 急性毒性 acutetoxicity 是指机体一次接触或在24小时内多次接触外来化学物后所引起的快速剧烈的中毒效应 结构与功能变化 一次接触因给予途径不同定义不同 口服和注射指瞬间将受试物给予机体 吸入和皮肤接触指在特定期间内 24小时 机体持续接触受试物 2020 3 26 3 1 2急性毒性试验的目的 确定受试物使一种或几种实验动物死亡的剂量水平 LD50 LD100 LD01 以初步估计该化合物对人类毒害的危险性 为进一步的蓄积毒性试验 亚慢性与慢性毒性试验及特殊毒性试验提供剂量和判断指标的依据 阐明一种化合物的相对毒性 作用方式和特殊毒性表现 找出量 效关系 以便其毒性包括临床症状 生理生化和病理变化 毒性性质和可能的靶器官等有初步了解 为毒理学机制研究的初步探索 确定机体在环境中接触的受试物侵入机体的途径 研究受试物的代谢动力学过程 研究受试物急性中毒的预防和急救治疗措施 2020 3 26 4 1 3急性毒性试验设计 1 3 1试验动物的选择1 3 2动物分组及样本例数1 3 3动物喂养环境1 3 4剂量选择1 3 5染毒途径1 3 6试验周期1 3 7观察指标 2020 3 26 5 1 3 1试验动物的选择 原则是所选动物应使试验的结果能反映或预测人体接触时的反应 要求动物健康 体重差异不超过10 试验前应禁食16小时 同时尽量选用饲养管理方便 成本低的动物 1 3 1 1动物种属选择1 3 1 2动物品系选择1 3 1 3动物性别选择1 3 1 4动物年龄与体重选择 2020 3 26 6 1 3 1 1动物种属选择 啮齿类动物猫和犬猪和灵长目 2020 3 26 7 啮齿类动物 因缺乏呕吐反射而利于经口接触受试物的吸收 但不适于研究经口能引起呕吐的化学毒物的毒性 大鼠和小鼠繁殖力强 寿命短 食谱与人类似 便于分析比较明确的生物学指标 且价格低 易管理 大鼠在代谢和毒性反应上与人类较为接近 用于急性毒性试验占第一位 小鼠占第二位 家兔因盲肠较长 经口接触毒物在肠道的吸收充分 结果往往毒性大于其他动物 2020 3 26 8 猫和犬 因试验成本较高 不适于样本量大的试验如测定LD50 仅仅用来验证对毒性或对受试物的毒效应做深入研究时以及对某些毒作用的种属敏感性进行比较 猫和犬有高度发达的呕吐反射系统 有催吐效应的化合物在经口接触时应注意 2020 3 26 9 猪和灵长目 猪的食谱及皮肤结构与人接近 是一种用来估计外来化合物对人急性毒性危害水平较好的试验动物 但其饲养管理不便 价贵 也不适于样本量大的试验 灵长目动物在种系上与人类最接近 结果最能反映人体的反应 但其价格昂贵 获得较难 基本不用于急毒试验 2020 3 26 10 1 3 1 2动物品系选择 动物品系是指源于一个共同祖先而具有特定基因型的一群生物 不同品系的同种动物 可对同一被检物发生不同反应 即存在品系差异 为了在同种动物中减少这种遗传特性所决定的品系差异 在毒性试验中 最好采用同品系动物 即纯种动物 2020 3 26 11 1 3 1 3动物性别选择 性别的选择依试验目的 要求而定 如需要着重观察受试验物对雄性动物生殖功能的影响 应选用雄性动物 如为受试物的致畸形试验作准备 则可只选用雌性动物 如一般地阐明受试物毒性的大小与性质 则应雌雄各半 2020 3 26 12 1 3 1 4动物年龄与体重选择 动物年龄一般选用初成年者 最常用的是出生2 3月龄 体重分别为200克和20克左右的大 小鼠 犬则需喂养1年左右 豚鼠体重200 250克 家兔2000 2500克 猫1500 2000克 如需研究受试物急毒作用的年龄差别 则应选用不同年龄组动物 2020 3 26 13 1 3 2动物分组及样本例数 试验动物应按年龄 性别和体重进行分层随机分组 随机方法可用抽签法和随机数字表法 即先将动物编号后 进行抽签或查随机数字表 注意随机不等于随意 每组样本例数小鼠10至20只 大鼠12至16只 家兔8至12只 2020 3 26 14 1 3 3动物喂养环境 实验动物喂养室室温应控制在22 3 家兔可控制在20 3 相对湿度30 70 无对流风 每笼动物数以不干扰动物个体活动及不影响试验观察为度 必要时单笼喂养 饲养室采用人工昼夜为好 早6点至晚6点进行12小时光照 其余时间黑暗 一般食用常规试验饲料 自由饮水 2020 3 26 15 1 3 4剂量选择 一般采用查文献和预试验 少量动物试验 估计LD50的范围 然后以此剂量为中间剂量 然后以4倍数上下各推两个剂量组 共5组 使相邻两对数剂量的差值相等 如P90表6 3 2020 3 26 16 1 3 5染毒途径 接触途径的选择应以人在生产生活环境中接触该化合物的方式为出发点 主要有 1 3 5 1经口接触1 3 5 2经呼吸道接触1 3 5 3经皮肤接触 2020 3 26 17 1 3 5 1经口接触 其是指将受试物经口摄入或用机械直接送入胃的过程 具体包括 灌胃 接触量和时间准确 但操作相对不便 掺入饲料 是将受试物掺入饲料或饮水中 让动物自行摄入的方法 其操作简便 但接触量和时间不够准确 吞咽胶囊 是将受试物装入胶囊内 放入动物舌咽部迫使动物咽下 本法操作不便 仅适于较大的动物 2020 3 26 18 1 3 5 2经呼吸道接触 其适于在常温 常压下生产生活中以气态 蒸汽态 气溶胶 烟雾与粉尘状态存在的受试物的急性毒性试验 具体接触方式有 吸入 将试验动物置于含有一定浓度的受试物的染毒柜或其它容器中 让动物自然吸入 和注入 将受试物直接注入试验动物的气管或肺内 该途径接触的持续时间可依据试验要求而定 毒性大的接触时间可短些 毒性小的可长些 国内一般在求LC50时为2小时 2020 3 26 19 1 3 5 3经皮肤接触 液态 粉尘态和气态外来化学物均有接触皮肤的机会 不仅与外露皮肤接触并被吸收 有的还能穿透衣服经皮肤吸收 外来化学物经皮肤吸收是指角质层完整的皮肤 若皮肤破损 化学物经真皮直接吸收 而与静脉吸收的机制相似 2020 3 26 20 1 3 6试验周期 急性毒性试验除计算受试物的LD50 LC50外 还需要通过观察实验动物的中毒症状判断受试物的毒作用性质 推断中毒的靶器官等 因此 试验周期一般为2周 2020 3 26 21 1 3 7观察指标 应根据急毒试验的目的来确定观察指标 1 3 7 1致死量 浓度1 3 7 2中毒症状1 3 7 3死亡及其时间1 3 7 4体重1 3 7 5其他指标 2020 3 26 22 1 3 7 1致死量 浓度 常用LD50 LC50 其计算一般采用改良寇氏 k rber 法 LD50 log 1 Xm i Pi 0 5 Xm为最大剂量的对数 i为相邻两对数剂量之差的绝对值 Pi为各组阳性反应率的总和 毒性较大的用LD5 LC5 毒性剧烈的用LD1 LC1 2020 3 26 23 1 3 7 2中毒症状 在急性毒性试验中 动物的中毒症状及死亡一般出现在给予受试物24 48小时内 故观察1周即可 如中毒反应出现较迟 主要在给受试物后48小时 4天 则观察期也应相应延长至2 4周 特别在48 72小时内要仔细观察各剂量组动物的一般反应 临床表现 死前表现及这些反应出现的时间 具体观察指标见P123表6 1 2020 3 26 24 1 3 7 3死亡及其时间 观察试验动物接触受试物后的死亡过程有利于探讨其中毒机制或死因 在同系化学物中 有些在致死量下表现出动物先兴奋后抑制 死亡时发生抽搐 而有的则只引起抑制症状 表现精神萎靡 反应迟钝 并在抑制状态下慢慢死亡 表明同系物之间的毒作用有差别 2020 3 26 25 1 3 7 4体重 在急毒试验中对于存活动物尤其是低于LD50组的动物 应观察动物体重变化 以便了解受试物引起的中毒效应是短暂的还是较长期的 尽管引起动物体重下降或增长率减慢的原因较为复杂 如受试物影响食欲或消化系统功能而使动物厌食或拒食可使体重下降 受试物可能会引起腹泻而引起食物的吸收利用也可导致体重下降 影响肾功能可使水盐代谢的紊乱而可影响体重 2020 3 26 26 1 3 7 5其他指标 根据上述某些指标的阳性结果可进一步扩大观察项目 如测定体温 心电 脑电等生理学指标或某些生化指标 有利于深入探讨受试物的毒作用特征 对死亡动物要取部分组织进行病理解剖学检查 记录各器官系统肉眼可见的病变 停止观察后也应抽取部分存活的动物进行病理解剖学检查 病理解剖学检查对迟发性死亡动物 尤其是发生双峰死亡的现象是必要的 双峰死亡指早期死亡较多 继而减少 然后又出现大批死亡的现象 病理解剖学检查对估计受试物的毒理作用有一定的意义 并可为亚慢性 慢性和其它毒性试验的设计提供依据 2020 3 26 27 1 4急性毒性替代试验 1 4 1固体剂量法 fixeddoseprocedure 1 4 2急性毒性分级法 acutetoxicclassmethod 1 4 3上下移动法 阶梯法 up downmethod 2020 3 26 28 1 4 1固定剂量法 与经典方法不同的是它不以动物死亡作为观察终点 可以利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒 从而观察化学物的毒性反应来对化学物的毒性进行分级 实践证明可大量节省试验动物 实验选择的剂量范围是5 50 500mg kg 最高限量是2000mg kg 欧共体 EEC 的急性经口毒性分级标准是 高毒 LD50 25mg kg 有毒 LD50为25 200mg kg 有害 LD50为200 2000mg kg 不分级 LD50 2000mg kg 4个等级 2020 3 26 29 1 4 2急性毒性分级法 它是以死亡为终点的分阶段试验法 每阶段3只动物 根据死亡动物数 平均2 4阶段即可判定急性毒性 使用动物数量少 首选大鼠进行试验 在25 200 2000mg kg中选择一个剂量开始试验 并据其结果判断 不需进一步试验进行分级 下阶段以相同剂量的另一种性别试验 下阶段以较高或较低的剂量水平进行试验 动物观察14天 在染毒当天观察体征和死亡至少2次 之后每天观察1次 染毒前和每周测体重 所有动物进行大体解剖 必要时进行组织病理学检查 病检 2020 3 26 30 1 4 3上下移动法 它以死亡为终点但也可用于观察不同的终点 特点是所需的动物数更少 根据初步的资料确定第一个动物接受化学物的剂量 由第一只动物染毒后的反应决定第二只动物接受化学物的剂量 如果动物死亡 则下一个剂量降低 如存活则下一个剂量增高 该方法需要选择一个合适的剂量范围 使大部分动物所接受的化学物剂量都在真正的平均致死量左右 2020 3 26 31 1 5LD50应用中的有关问题 LD50具有重要的毒理学意义 在药物研究中 评价药物急毒的大小 比较不同药物毒性的大小 计算药物的治疗指数 为后续的重复给药毒理学试验提供剂量参考 比较不同途径的LD50值 获得生物利用度的信息 试验中毒量及其体征为临床不良反应监测提供参考 LD50的局限性 评价新药及化学物时提供的信息较少 实用性有限 影响因素多 如性别 年龄 身体状况及环境因素等 物种差异性影响大 经典试验所需的动物数量多 2020 3 26 32 1 6急性毒性评价 在生产 运输 贮存和销售使用过程中也需要根据外来化学物的毒性分级 采取相应的防护措施 为评价外来化学物急毒的强弱及对人类的潜在危害程度 国际上提出了化学物急毒的分级标准用以对急毒进行评价 为便于比较化学物的毒性及有毒化学物的管理 国内外根据LD50的大小提出了许多分级标准 WHO公布的 全球化学品统一分类和标签制度 GHS 中关于急性毒性危险类别和标签的要求见P125表6 2 注意 急毒不大 慢毒可能很大 因此不能将急毒分级与慢毒分级混淆 2020 3 26 33 2局部刺激试验 目的在于了解化学物对眼和皮肤的局部刺激性和腐蚀性 2 1眼刺激试验 eyeprimaryirritationtest 2 2皮肤原发性刺激试验 skinprimaryirritationtest 2 3皮肤致敏试验 skinsensitizationtest allergiccontactdermatitistest 2020 3 26 34 2 1眼刺激试验 其观察终点为眼刺激和眼腐蚀 眼刺激 eyeirritation 指眼前表面接触受试物后产生的局部可逆性炎症变化 眼腐蚀 eyecorrosion 指眼前表面接触受试物后产生的局部不可逆性组织损伤 方法用Draize试验 家兔4只 滴眼后观察结膜 红 肿 分泌物 角膜 混浊度及范围 和虹膜 红 肿 的反应 按规定的分级标准进行评分 一般观察7天 必要时延长至21天 2020 3 26 35 2 2皮肤原发性刺激试验 皮肤刺激 dermalirritation 指皮肤接触受试物后产生的局部可逆性炎症变化 皮肤腐蚀 dermalcorrosion 指皮肤接触受试物后产生的局部不可逆性组织损伤 不宜进行皮肤刺激试验的情况 构效关系及理化性质推测可能有腐蚀性物质 急毒经皮试验有强系统毒性的物质 急毒经皮试验染毒量达2000mg kg仍未产生皮肤刺激体征的物质 试验采用家兔或豚鼠 观察时间应足以观察到可逆或不可逆刺激作用 一般不超过14天 影响试验的因素 皮肤的完整性受破坏 固态物的物理性状 受试物在皮肤表面封闭染毒的严密程度 动物的年龄与皮肤结构的关系 种属差异 一般敏感顺序为 兔 豚鼠 人 猪 2020 3 26 36 2 3皮肤致敏试验 皮肤致敏是一种对化学物免疫介导的皮肤反应 人体这类反应表现为 瘙痒 红斑 水肿 丘疹 水疱等 试验动物常选豚鼠 试验分两个阶段 诱导接触 inductionexposure 是以较低或中等浓度受试物对皮肤重复染毒 涂皮或皮下注射 一般需14天 激发接触 challengeexposure 是间隔10 14天后 用激发剂量 低于诱导时的剂量 受试物处理未染过毒的皮肤部位 然后观察24小时 48小时和72小时后皮肤反应 以皮肤反应程度进行评分 比较诱导及激发后皮肤反应情况 以判断受试物能否产生皮肤过敏反应 2020 3 26 37 3蓄积毒性作用及其评价 3 1基本概念3 2实验方法及其评价3 2 1蓄积系数法3 2 2生物半衰期法3 2 3蓄积率3 3相关机体耐受性 2020 3 26 38 3 1基本概念 蓄积作用指反复多次接触同一化学物时 因前次接触时未完全自机体清除 使其多次接触后在体内的总量不断增加的现象 蓄积性指化学物具有蓄积作用的性质 贮库指容易蓄积化学物的组织部位 常见的有血浆蛋白 脂肪组织 肝 肾及骨骼 蓄积作用一方面包括化学物在体内量的增加 另一方面是组织结构和功能改变的累积 2020 3 26 39 3 2实验方法及其评价 任何毒物都可在体内蓄积 有些毒物分次进入的量虽小 但长期接触仍可产生毒性 有些毒物虽然毒性较小 但大量接触也可产生毒性 化学物在体内的蓄积现象是发生慢性中毒的物质基础 蓄积毒性试验是检测外来化学物蓄积性大小的试验 以了解某种外来化学物在体内的蓄积情况和程度 并可为慢毒实验设计提供依据 短期试验 Short termtest 指在数日内 7 14天 每天使试验机体接触一次受试物的试验 以探讨较大剂量和较短时间的毒性作用 其与急性毒性试验不同 2020 3 26 40 3 2 1蓄积系数法 本法是一种生物效应的试验方法 原理是在一定期限内以低于致死量 LD50 间隔分次给予受试动物 直至出现预计的毒性效应为止 计算达到预计效应的总蓄积剂量 求出此蓄积剂量与一次接触该化学物产生相同效应所需剂量的比值 蓄积系数K ED50 n ED50 l n 多次接触产生相同效应的剂量总和 l 单次接触产生相同效应的剂量 K越大表明蓄积性越小 K 1表示高度蓄积 1 K 3表示明显蓄积 3 K 5表示中等蓄积 K 5表示轻度蓄积 蓄积系数的具体试验方法有 固定剂量法定期递增剂量法20天试验法 2020 3 26 41 固定剂量法 先按常规方法测定LD50 然后用另一批条件相同的动物 分成2 4组 每组10 20只 雌雄各半 试验组每日定时定量 1 20 1 5LD50之间 并以相同途径给予受试动物 试验期间每日记录动物的蓄积死亡数至累计发生一半动物死亡 异外死亡除外 即可计算K值 若接触蓄积剂量已达到5个LD50量 也可停止试验 表明K大于5 单次接触量应根据动物体重作相应调整 试验期最长100天 每次接触量1 20LD50 最短25天 每次接触量1 5LD50 2020 3 26 42 定期递增剂量法 在测出LD50后 同上法选择相同条件的动物 分为接触组和对照组 试验以4天为一期 每天给相同剂量受试物 开始按1 10LD50给予 此后每期给予量按等比级数递增1 5倍 连续接触20天即可结束试验 若试验期中只要受试物引起一半动物蓄积死亡 也可结束试验 2020 3 26 43 20天试验法 本法是我国对农药及食品安全性的毒理学评价中提出的方法 采用体重200克左右的成年大鼠 也可用小鼠 每个剂量组雌雄动物各10只 各组受试物剂量分别为LD50的1 20 1 10 1 5及1 2 另设对照组 每天染毒1次 连续20天 各组染毒累量可达1 2 4和10LD50 再继续观察7天 若1 20LD50组有动物死亡 且有量效关系 则为强蓄积性 应放弃继续试验 若到1 2LD50组才有动物死亡 则为弱蓄积性 2020 3 26 44 3 2 2生物半衰期法 生物半衰期 t1 2 是指外来化学物在体内消除一半所需要的时间 其可反应化学物在体内的蓄积量 蓄积量越大毒性反应越强 但不一定呈平行关系 t1 2的测定可用作图法 先求出消除速率常数K 即以时间为横坐标 一级动力学消除物质以血浆对数浓度为纵坐标 零级动力学消除物质以血浆浓度为纵坐标 其斜率为K 再根据不同动力学消除特性求t1 2 一级消除t1 2 0 693 k 零级消除 0 5C0 K 多数物质以一级消除 有零级消除特性的物质在接触量很小时 也以一级消除 但累积到一定程度后转变为零级消除 除吸入接触外 蓄积极限值可按下列公式估计 L 1 44X每日吸收量Xt1 2 日 2020 3 26 45 3 2 3蓄积率 蓄积率是指在一定时间内 外来化学物在体内的蓄积量与同一期进入机体总量的百分比 其越高该化学物的蓄积性越大 其测定可用化学测定法测定 但较困难 实际采用生物测量法进行测定 将动物分为试验组和对照组 试验组先在一定时期 蓄积期 内每日给予一定量的受试物 但不得有动物死亡 蓄积一定量后同时与对照组进行LD50的测定 再按下列公式计算蓄积率 蓄积率 对照组LD50 试验组LD50 蓄积期试验组给予受试物的总量 2020 3 26 46 3 3相关机体耐受性 耐受性是指在一定剂量下未出现或出现程度较预期低的反应的现象 在蓄积试验中 有时常于实验结束时将存活的动物给予一次冲击剂量 一般为LD50 然后与未进行预先化学处理的对照组的死亡率进行比较 以确定是否具有耐受性 若试验组较对照组的死亡率低 则具有一定的耐受性 若高于或与对照组的死亡无差别 则无耐受性 蓄积性与耐受性往往同时存在 有些以蓄积性为主 而有些以耐受性为主 2020 3 26 47 4亚慢性和慢性毒性作用及其评价 4 1基本概念及试验目的4 2亚慢性毒性试验设计4 3慢性毒性试验设计4 4亚慢性 慢性毒性作用评价 2020 3 26 48 4 1基本概念及试验目的 4 1 1亚慢性 慢性毒性作用的概念4 1 2亚慢性毒性作用的试验目的4 1 3慢性毒性作用的试验目的 2020 3 26 49 4 1 1亚慢性 慢性毒性作用的概念 亚慢性毒性作用指试验动物连续多日接触较大剂量的外来化学物所出现的中毒效应 连续多日约相当于受试动物寿命的1 30 1 10 一般环境毒理学和食品毒理学要求连续接触3 6个月 工业毒理学要求3个月 呼吸道接触主张30 90天试验 每天6小时 每周5天 皮肤接触试验为30天 较大剂量上限应小于急毒试验的LD50 慢性毒性作用指以低剂量外来化学物长期给予试验动物接触 其对试验动物产生的毒性效应 2020 3 26 50 4 1 2亚慢性毒性作用的试验目的 目的主要是为慢毒试验提供设计依据 探讨试验动物长期接触外来化学物可引起有害效应的剂量 以估计该化学物慢性接触的危险性 为进一步进行慢毒试验提供接触剂量的设计范围 探讨亚慢性毒性的阈剂量 浓度 确定对动物的毒作用性质 发生毒效应的类型和靶器官 并初步确定最大无作用量 从而确定慢性毒性作用的观察指标 根据亚慢性毒性的阈剂量和无作用量 估计慢性接触的危险性 为接触该化学物的安全限量标准提供初步依据 以确定是否需进一步进行慢毒试验 了解受试物对动物繁殖及对子代的致畸作用 为评价受试物能否应用于食品提供依据 2020 3 26 51 4 1 3慢性毒性作用的试验目的 慢毒试验是外来化学物一般毒性评价程序中最后阶段的观察 其目的是为了评价动物长期接触某受试物后可能出现的毒性作用 尤其是进行性或不可逆的毒性作用以及致癌作用 以确定外来化学物的毒性下限 即长期接触该化学物可以引起机体危害的阈剂量和最大无作用量 为最终评价受试物能否应用于食品提供依据 为进行该受试物的危险评价与制定人接触该物质的安全限量提供毒理学依据 如最高允许浓度和每日允许摄入量等 2020 3 26 52 4 2亚慢性毒性试验设计 4 2 1试验动物的选择4 2 2试验动物的喂养环境4 2 3剂量的选择与分组4 2 4染毒途径4 2 5试验周期4 2 6观察指标 2020 3 26 53 4 2 1试验动物的选择 原则上要求对受试物代谢过程基本与人类相似 应当是急性毒性试验已证明的对受试物敏感的种属和品系 同时还应考虑与慢性毒作用试验中预计使用的动物种属和品系相同 若无法掌握这一情况 则应有两种实验动物 一种为啮齿类 另一为非啮齿类 以便了解受试物毒性特征 也应参考观察指标的需要而选择 如需多次抽血检查则不宜用小鼠 性别选择一般雌雄兼用 特殊试验可选用单性别动物 如对性腺影响试验 年龄选择大鼠4周 重50克 小鼠3周 重10克 2020 3 26 54 4 2 2试验动物的喂养环境 在亚慢性试验期间 动物饲养条件及环境可能影响毒性效应 应注意营养平衡和环境的稳定 必须有营养合理的饲料 充足干净的饮水和清洁的生活环境 并保持适宜的温度和湿度 以保证动物健康 当受试验物在饲料中的比例较高 大于5 时 须考虑其可食性及营养平衡问题 还要避免经胃肠代谢后的毒物又被动物摄取而影响试验结果 不同物种的动物应分室饲养 笼具要保证实验动物可自由活动 必要时单笼饲养 且应有人工昼夜设施 2020 3 26 55 4 2 3剂量的选择与分组 所选剂量上限应在试验期不引起动物死亡或个别死亡 但要有明显的中毒效应或靶器官出现明显损伤 可参考急毒试验的阈剂量为其上限 也可用1 20 1 5LD50 亚慢性试验应求量 效关系 因此至少设置3 4个剂量组 1个正常对照组 必要时加1个溶剂对照组 每组动物大鼠20 40只 家兔10 20只 狗6 8只 猴2 4只 若试验中期需处死部分动物作病理解剖检查时应相应增加动物例数 2020 3 26 56 4 2 4染毒途径 染毒途径先要尽量模拟人类在环境中接触该受试物的途径和方式 其次应与后来预期要进行的慢毒试验的接触途径一致 经口接触一般采用饲喂法 但应注意动物厌食或拒食 经呼吸道吸入接触的时间随所接触受试物而定 如为工业毒物可接触1 4小时 环境污染则可适当延长至4 8小时 每日接触受试物应定时 以减小接触量和反应误差 2020 3 26 57 4 2 5试验周期 试验周期一般占实验动物寿命的1 10 因为不同动物的寿命不同导致实验周期有所不同 从几个月至1年不等 一般对长周期 经常接触的受试物可选择90天试验周期 而对阶段性接触的受试物可选择30天 2020 3 26 58 4 2 6观察指标 亚慢性试验中观察指标比较广泛 其选择十分重要 常根据急性 蓄积性试验提供的线索及相关资料 选择一些特异和非特异指标 包括一般性指标 血液和行为学检查 生理生化指标 病理解剖学与病理组织学检查及器官系数测定等 4 2 6 1一般指标4 2 6 2病理学检查4 2 6 3特异指标 2020 3 26 59 4 2 6 1一般指标 为非特异指标 是外来化学物对机体毒性作用的综合性总体反映 主要包括 动物体重 反映化学物对消化系统和代谢的影响 食物利用率 摄食量与体重的增长比率 同样反映化学物对消化系统和代谢的影响 症状 主要有毛色 眼分泌物 呼吸 神态及行为 脏器系数 脏器湿重与体重的比率 可反映具体受损的器官 一般生化指标 主要是血象和肝肾功能指标 2020 3 26 60 4 2 6 2病理学检查 凡是在染毒过程中死亡的动物 均应即使解剖进行病理组织学检查 必要时作组织化学或电镜检查 检查时所选脏器应参照急性毒性试验的脏器改变或亚慢性毒性试验的中毒症状而定 必要时可进行所有脏器的病理组织学检查 2020 3 26 61 4 2 6 3特异指标 特异指标是指对机体亚慢性毒性作用本质的特征性指标 其与受试物的中毒机制密切相关 指标选定一是全面分析受试物急性毒作用特征 初步发现主要危害的系统 器官和组织 来发现一些敏感或特异性指标 另一方面是通过文献检索 参考一些化学物的同系物 某些特殊基团具有的特定毒性 利用构效关系的共性来选择特异性指标 2020 3 26 62 4 3慢性毒性试验设计 慢毒试验是制定人体日允许摄入量所需的关键性资料 4 3 1试验动物的选择4 3 2试验动物的喂养环境4 3 3剂量的选择与分组4 3 4染毒途径4 3 5试验期限4 3 6观察指标 2020 3 26 63 4 3 1试验动物的选择 因慢毒试验为动物的大部分生命周期甚至终身 因此只能选用生命周期较短 2 3年 的动物 又要对饲养条件 生化系统 繁殖 自发性疾病均有比较系统的了解 故传统上选用大鼠 3 4周 50 70克 小鼠 3周 10 12克 并要求品系明确一致 取决于被检物的毒作用部位及毒剂量的总的敏感性 一般选对致癌物敏感的品系 雌雄各半 动物数量要求与亚慢性毒性试验相似 2020 3 26 64 4 3 2试验动物的喂养环境 饲养条件和饲养环境要求与亚慢性毒性试验相同 如应保证试验动物有温湿度适宜的生活环境及合理的营养 注意动物的营养成分可影响慢毒试验的结果 如半合成饲料可增加致癌物的敏感性 黄酮类及大蒜素相反 2020 3 26 65 4 3 3剂量的选择与分组 试验分零剂量组 预期无作用剂量组 阈剂量组 发生轻微但有明确毒效应剂量组和发生明显的毒效应甚至亚致使死水平剂量组 以求量效关系 必要时加溶剂对照组 剂量选择参考 亚慢毒试验结果 高剂量组为1 5 1 2阈剂量 轻微毒效应组为1 20 1 10阈剂量 慢毒阈剂量组为1 50 1 20阈剂量 预期无作用剂量组为1 10最大无作用量 1 100阈剂量或10 50倍人群实际最大摄入量 急毒实验结果 高剂量组为1 10LD50 慢毒阈剂量组为1 100LD50 预期无作用剂量组为1 1000LD50 美国环保局建议 0 125MTD和0 25MTD MTD 最大耐受量 试验组动物较对照组动物体重减轻不超过10 无死亡 无中毒症状和病理损伤的最大量 2020 3 26 66 4 3 4染毒途径 慢毒试验多采用经胃肠道与呼吸道接触 经胃肠道接触一般将受试物与食物或饮水混合 由动物自然摄入 但若受试物有异味或易水解时可采用每日定时灌胃 经呼吸道接触 依试验要求定每日接触时间 如为工业毒物的试验通常要求每日吸入4 6小时 如为环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长时间 2020 3 26 67 4 3 5试验期限 其依试验的要求和实验动物种类而定 使用大 小鼠时 工业毒理学要求6个月 食品和环境毒理学一般要求1年以上至2年 若与致癌试验结合进行 则最好长达接近动物的预期寿命 甚至终生 有人认为大鼠90天试验即可确定慢性无作用水平 也有主张终生接触才能全面反映受试物的慢毒效应及求出阈剂量或无作用量 2020 3 26 68 4 3 6观察指标 应以亚慢毒试验的观察指标为基础 选择亚慢毒试验中已呈现有意义的变化指标 一般常规观察指标包括肝 肾功能 健康状况 体重 血液及其它生化指标 对死亡动物及试验结束时应作病检 为减小误差和排除漏检 应注意 试验前应对观察指标进行正常值检查 剔除差异大的动物 观察应与对照组同步进行并作对比 检测方法应稳定 并有质量控制 应在不同间隔 于6 12 18个月 处死部分动物检测 以了解是否有进行性和可逆性变化 2020 3 26 69 4 4亚慢性 慢性毒性作用评价 了解受试物毒性的大小及靶器官并找出敏感的毒效应指标 即最早出现在最低剂量组并与对照组比较差异有显著性的毒效应指标 4 4 1基本评价参数4 4 2亚慢毒资料评价4 4 3慢毒资料评价4 4 4综合结论 2020 3 26 70 4 4 1基本评价参数 阈剂量是敏感毒效应指标出现改变的最小剂量 Limch 用最低有害作用水平 lowestobservedadverseeffectlevel LOAEL 或最小作用量 MED 表达 最大无作用量 maximalno effectdose 是不引起机体某种毒效应的最大剂量 用无明显作用水平 NOEL 或无明显有害水平 NOAEL 表达 LOAEL或NOAEL是评价化学物对机体损害的主要指标 但应注明动物 试验条件及观察指标 以此为基本可制定化学物的接触极限 2020 3 26 71 4 4 2亚慢毒资料评价 我国 食品安全性毒理学评价程序 中规定 亚慢毒试验中 最大无作用剂量小于或等于人可能摄入量的100倍 则表示毒性很强 应放弃该化学物的使用 若最大无作用剂量在100 300倍之间 可进行慢毒试验 若大于或等于300倍 则不必进行慢毒试验 可直接进行毒性评价 2020 3 26 72 4 4 3慢毒资料评价 如慢毒试验中未发现致癌性 最大