NEB-T4 DNA Lagase注意事项

一 关于一 关于 NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答连接酶的使用方法和常见问题及解答 1 产品特性和使用方法 产品特性和使用方法 产品说明 该酶催化契合的双链 DNA 或 RNA 的 5 磷酸末端和 3 羟基末端形成磷酸二酯键 该酶不仅能够催化平滑末 端或粘性末端 DNA 之间的连接 还可以修复双链 DNA RNA 或 DNA RNA 杂交双链中的单链切口 1 来源 源于 E coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 2 应用 限制性酶切片段的克隆 3 将 linker 或 adapters 连接到 DNA 片段的平滑末端 反应缓冲液 1X T4 DNA Ligase Buffer 50 mM Tris HCl 10 mM MgCl2 10 mM DTT 1 mM ATP 25 g ml BSA pH 7 5 25 C 推荐 DNA 浓度 0 1 1 M 的 5 末端 使用注意 ATP 是反应必须的辅因子 这一点与要求 NAD 作辅因子的大肠杆菌 DNA 连接酶不同 如在反应体系中补加 1 mM 的 ATP 连接反应还可以在 NEB 提供的四种限制性内切酶缓冲液 NEBuffers 或在 T4 DNA 多聚核苷酸激酶缓冲液中进行 质量保证 无核酸内 外切酶污染 每批 T4 DNA 连接酶均通过模拟克隆实验进行检测 该实验可以检测出待连接 DNA 末端的任何破坏 结果表明 99 9 的 DNA 末端未受任何降解 单位定义 粘性末端活性单位 在 20 l 连接反应体系 0 12 M 300 g ml 的 5 末端浓度条件下 16 C 反应 30 分钟 能使 50 的经 Hind 消化的 DNA 片段连接所需的酶量定义为一个 NEB 单位 一个粘端连接活性单位一个粘端连接活性单位 0 015 个韦氏 个韦氏 ATP PP 交换 单位交换 单位 4 一个韦氏单位一个韦氏单位 67 个粘端连接活性单位 个粘端连接活性单位 浓度 400 000 units ml 和 2 000 000 units ml 贮存条件 50 mM KCl 10 mM Tris HCl pH 7 4 0 1 mM EDTA 1 mM DTT 200 g ml BSA 和 50 的甘油 20 C 贮存 热失活条件 65 C 加热 10 分钟 室温连接反应 为方便起见 连接反应可以在室温 室温连接反应 为方便起见 连接反应可以在室温 20 25 C 条件下进行 粘性末端连接 在 条件下进行 粘性末端连接 在 20 l 反应体系中加反应体系中加 入入 1 l T4 DNA 连接酶 反应连接酶 反应 10 分钟 平滑末端连接 在分钟 平滑末端连接 在 20 l 反应体系中加入反应体系中加入 1 l T4 DNA 连接酶反应连接酶反应 2 小时 或小时 或 者加入者加入 1 l 高浓度高浓度 T4 DNA 连接酶反应连接酶反应 10 分钟 分钟 另外 NEB 的快速连接试剂盒 Quick Ligation Kit NEB M2200V 15 个反应 是独有的可以在室温 5 分钟条件下连接 平滑末端和粘性末端的试剂盒 图 1 在 25 C 条件下 用 1 unit 1 400 稀释后取 1 l T4 DNA 连接酶连接 DNA Hind 片段 4 碱基粘端 不同反应 时间的结果 图 2 在 20 l 反 逑抵校 貌煌 康腡 4 DNA 连接酶连接平滑末端的 DNA Hae 片段 16 C 温育 30 分钟 图 2 在 20 l 反 逑抵校 貌煌 康腡 4 DNA 连接酶连接平滑末端的 DNA Hae 片段 16 C 温育 30 分钟 二 常见问题及解答 Q1 有哪些潜在原因可导致用 T4 DNA 连接酶连接后转化失败 A1 反应体系内无 ATP 或 Mg2 可导致连接失败 使用随酶提供的 buffer 或向其它兼容的 buffer 中加入 ATP 含 ATP 的 Buffer 保存超过 1 年 其内 ATP 可能会降解 导致连接失败 当补加 ATP 时 确定补加的是核糖核酸 ATP 而不是 脱氧核糖核酸 ATP 因为后者不起作用 反应体系中盐浓度过高或 EDTA 含量高都可导致连接失败 纯化 DNA 去磷酸化步骤完成后 CIP BAP 或 SAP 失活不彻底 根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶 DNA 浓度过高导致连接后产生的均是线性 DNA 保持总 DNA 浓度在 1 10 g ml 之间 连接末端为单碱基突出末端 使用最高至 5 l 高浓度连接酶 16 C 过夜连接 插入片段和质粒没有磷酸化 注意 如果载体已经去磷酸化了 而引物又没有磷酸化会导致连接失败 订购磷酸化的 引物或对引物进行磷酸化 加入过多的连接混合物至感受态细胞 50 l 感受态细胞应加入 1 5 l 连接混合物 插入片段太大 不能进行环化 降低插入片段的浓度 并使用高浓度连接酶 16 C 过夜连接 连接酶失活 用 lambda HindIII 或其它可行的底物进行检测 连接混合物含有 PEG 且连接反应过夜 长时间地在含有 PEG 的条件下连接可导致转化效率降低 这可能是由于逐渐 产生的大片段线性 DNA 抑制了转化效率 快速连接试剂盒 NEB M2200 的 buffer 含有 PEG 电转化前没有提纯连接混合物 电转化必须去除 buffer 否则盐会导致瞬间放电 击穿细胞 可用透析或柱纯化的方 法纯化连接混合物 虽然快速连接试剂盒 NEB M2200 buffer 中含有的 PEG 不会导致击穿细胞 但是会抑制电转 化 所以必须去除 可用柱纯化方法去除 PEG Q2 解决转化问题时 还有什么因素需要考虑 A2 感受态细胞出了问题 设置下面列出的实验对照 必要时更换新鲜感受态细胞 细胞不是感受态 设置下面列出的实验对照 必要时更换新鲜感受态细胞 大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白 试用 pMAL 系统 NEB E8000S 表达 MBP 麦芽糖结合蛋白 融合蛋白 或者 试用其它不需要大肠杆菌的表达系统 连接的 DNA 片段含有反向重复的序列 不能用大肠杆菌筛选 如果可能去除重复序列 或试用其它不需要大肠杆菌 的表达系统 插入序列来自哺乳动物 植物或者含有甲基化的胞嘧啶 会被很多大肠杆菌菌株降解 使用 mcrA mcrBC 和 mrr 缺 失菌株 重组子太大 10 000 bp 不能进行化学转化 用电转化 Q3 内切酶酶切反应后 有什么因素可以导致 T4 DNA 连接酶连接和后续的转化失败 A3 内切酶酶切不充分 如果酶切位点位于 PCR 产物的末端 识别位点末端侧需要加至少 6 个保护碱基 用对照底物检 测内切酶的活性 内切酶没有完全失活 如果内切酶不能热失活 用酚 氯仿抽提纯化 DNA 内切酶的星号活性消化了载体或插入片段 跑胶检测 DNA 如果存在多余的条带 减少内切酶使用量或减短反应时 间 DNA 或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染 破坏了 DNA 末端 酚 氯仿抽提纯化 DNA 检查内切酶的质量检测资料和 注意事项 如果连接 QC 不佳或外切酶活性高 减少内切酶量或縮短反应时间 Q4 使用 T4 DNA 连接酶 需要设置什么对照来检测细胞和 DNA A4 注意 每个对照组都使用相同浓度的 DNA 一般为 0 1 1 0ng 转化 转化空载体 未切割的 至感受态细胞 目的 检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性 分别涂布于含有和不含有抗 生素的平皿上 转化线性化后的载体 目的 检测未切开质粒的量 克隆数应该小于步骤 1 的 1 酶切再连接质粒 目的 检测连接酶的活性以及 DNA 末端的完整性 克隆数应该与步骤 1 相近 酶切后去磷酸化再连接质粒 目的 检测未完全去磷酸化的背景 克隆数应该小于步骤 1 的 1 Q5 什么情况下选用 T4 DNA 连接酶 A5 T4 DNA 连接酶应该被用来连接粘性末端 室温 10 分钟 或平末端 室温 2 小时 或者连接反应需要过夜 如果 需要热失活连接酶 选用用 T4 DNA 连接酶 高浓度 T4 DNA 连接酶被用来连接单碱基突出末端 或连接需要长时间孵 育来环化的大片段 比如 BAC 细菌人造染色体 结构 Q6 T4 DNA 连接酶能与快速连接 buffer 兼用吗 A6 可以 高浓度 T4 DNA 连接酶可以直接取代 如果是普通浓度的 T4 DNA 连接酶 将孵育时间从 5 分钟延长到 15 分钟 不要进行热失活 因为加热会让 buffer 内的 PEG 抑制转化 反应时间延长也会降低转化效率 Q7 T4 DNA 连接酶连接应该加多少 DNA A7 单位定义用的是 0 12 M 300 g ml lambda HindIII 高浓度的 DNA 用于 linker 的连接 为了促进环化 有利于 转化 应该控制总 DNA 浓度于较低水平 载体 片段总浓度应为 1 10 g ml 插入片段和载体的摩尔浓度比介于 2 6 之间 比例低于 2 1 会降低连接效率 高于 6 1 会促进形成多个插入 如果对 DNA 的浓度不确定 可以做不同比例的 多个连接反应 Q8 T4 DNA 连接酶可在其它 NEBuffers 中使用吗 A8 连接可以在内切酶所有 4 个标准 buffer 和 T4 多聚核苷酸激酶的 buffer 中进行 但需要加终浓度为 1mM ATP 确 定补加的是核糖核酸 ATP 而不是脱氧核糖核酸 ATP 因为后者不起作用 当使用 NEBuffer 3 时 如果 DNA 中盐浓 度较高可导致连接效率下降 Q9 T4 DNA 连接酶可以热失活吗 A9 可以 65 C 孵育 20 分钟可以失活 如果 buffer 快速连接试剂盒 NEB M2200 内的 buffer 中含有 PEG 则 不可热失活 否则会抑制转化 Q10 Weiss 单位 韦氏单位 与 NEB 粘性末端单位如何换算 A10 一个 NEB 粘性末端单位等于 0 015 Weiss 单位 即一个 Weiss 单位等于 67 个 NEB 粘性末端单位 二 关于 NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答 1 产品特性介绍以及使用方法 产品说明 本试剂盒可在室温 25 C 5 分钟条件下 完成 DNA 片段粘性末端或平滑末端的连接反应 应用 DNA 片段克隆入载体 文库构建 TA 克隆 Linker 连接 线性 DNA 的再环化 快速连接试剂盒的优点 快速 粘性末端或平滑末端 DNA 片段的连接只需 5 分钟即可完成 方便 可在室温条件下进行连接反应 灵活 适合于各种常规连接反应 试剂盒成分 Quick T4 DNA 连接酶 重组酶 2X Quick Ligation Buffer 贮存条件 连接酶 50 mM KCl 10 mM Tris HCl pH 7 4 0 1 mM EDTA 1 mM DTT 200 g ml BSA 和 50 甘油 2XQuick Ligation Buffer 132 mM Tris HCl 20 mM MgCl2 2 mM ATP 15 Polyethylene glycol PEG 6000 pH 7 6 25 C 美国专利号 4 582 802 注意 连接缓冲液用前彻底混匀 避免反复冻融 快速连接步骤 混合 50 ng 载体和 3 倍摩尔量的插入片段 用蒸馏水调整总体积为 10 l 加入 10 l 2 Quick Ligation Buffer 混匀 加入 1 l Quick T4 DNA 连接酶 彻底混匀 稍事离心 室温 25 C 作用 5 分钟 冰上冷却 然后转化或贮存于 20 C 不要热失活 热失活会急剧降低转化效率 转化步骤 快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化 NEB 推荐下述转化方法 冰上融化感受态细胞 在 1 5 ml 微量离心管中 将约 5 ng 2 l 的连接混合物冷却 在 DNA 样品中加入 50 l 感受态细胞 通过反复吹吸温和混匀样品 冰上放置 30 分钟 37 C 热休克 2 分钟 冰上冷却 5 分钟 加入 950 l 室温培养基 37 C 温育 1 小时 取 100 l 样品铺在适宜的培养基上 37 C 培养过夜 注意事项 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在 25 C 5 分钟达到反应终点 超过这个时间效果并不会更好 事实 上 连接两小时后转化效率便会降低 如果 25 C 反应过夜 则转化效率会降至 75 待连接的纯化 DNA 片段可以溶解在双蒸水 最好是 Milli Q 超纯水 TE 或其它稀释缓冲液中 要获得最适连接 在加 2 Quick Ligation Buffer 前 调整载体 DNA 和插入片段的体积到 10 l DNA 片段体积大于 10 l 的 则相应增加 2 Quick Ligation Buffer 的体积使之占总反应体积的 50 同样 DNA 连接酶的量也要加大 为保证有效连接 总的载体 DNA 插入片段的浓度应当在 1 10 g 之间 对单插入来说 插入片段 载体比例在 2 6 之 间最好 低于 2 1 就会导致低的连接效率 高于 6 1 则会导致产生多个插入 如果 DNA 片段的浓度不能确定 就以不同 的比例做几个连接反应 电转化可以使转化效率提高几个数量级 在用快速连接反应产物做电转化以前 一定要降低 PEG 浓度 我们推荐使用 柱离心式 DNA 纯化方法 连接进程曲线 LITMUS28 载体 NEB N3628 经 EcoR 切割 平滑末端 或 Hind 切割 粘性末端 后 小牛肠碱性磷酸 酶处理 胶回收纯化 作为连接载体 插入片段来自 X174 DNA 的 Hae 消化产物 平滑末端 或 DNA 的 Hind 消 化产物 粘性末端 分别以 3 1 的插入片段 载体比例按照快速连接程序进行连接 连接产物转化入化学方法制备的大肠 杆菌 DH5 感受态细胞 在 LB amp 平板上 37 C 生长过夜 限制性酶切片段的克隆 3 2 快速连接试剂盒常见问题及解答 Q1 在应用快速连接试剂盒时 什么原因可以造成不完全连接或转化 A1 可能的原因有 快速连接反应被热失活了 快速连接缓冲液中含有 PEG 热失活后会抑制转化 快速连接混合液在电击之前没有纯化 快速连接缓冲液中含有的 PEG 会阻止电击反应 可以应用商业化的 DNA 纯化柱 纯化连接产物 过夜孵育进行连接反应 连接时间过长 快速连接缓冲液中存在的 PEG 就会降低转化效率 连接反应时间超过 30min 也不会获得更好的效果 反应体系中盐浓度过高 抑制了连接或转化反应 可以纯化一下 DNA 脱磷之后 所用的磷酸酶 CIP BAP 或 SAP 没有完全失活或去除 可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选 用热敏磷酸酶 NEB M0289 因为热敏磷酸酶在 65 5min 即可完全失活而无需纯化 DNA 另外一些影响因素 缓冲液超过一年 其中的 ATP 已经降解 补加新鲜的 ATP 至终浓度为 1mM DNA 浓度过高 连接产物只有线性分子 建议总 DNA 浓度在 1 10 g ml 之间 插入片段和载体没有磷酸基团 感受态细胞中加入的连接反应混合物过多 建议用量 50 l 感受态细胞中加入 1 5 l 混合物 插入片段长度超过 10 kb 反应条件无法满足环化要求 可以降低插入片段浓度 限制性内切酶切割不完全 当用于 PCR 产物末端的切割时 建议在两端的酶切位点上加至少 6 个保护碱基 限制性内切酶没有完全热失活 如果选用的内切酶不能被