《生化技术ta》PPT课件.ppt

生物大分子的分离 纯化 鉴定 定量技术 总论 常用生物大分子的分离纯化技术特殊要求的分离纯化方法 生化与分子生物学 生化与分子生物学的研究对象 生物内的分子生化 所有生物体内的分子 包括糖类 脂类 蛋白质 核酸 有机小分子等代谢与调控分子生物学 最初是生物大分子 即蛋白质 核酸 现也是所有细胞内的分子 是生物化学的高级阶段 基因水平 分子医学 分子遗传学分子免疫学分子病理学分子药理学分子毒理学分子检验学分子肿瘤学 分子生物学已成为工具性学科 已渗透到生命科学领域包括医学的每一分支学科中 从这点讲它已不是独立的学科 诺贝尔奖近百年的历史 在91项生理学或医学奖中有31项与生化与分子生物学有较密切的关系 而化学奖中则有34项相关 尤其是20世纪五十年代以来 52 的生理或医学奖和40 的化学奖属于生化与分子生物学领域 二者之和相当于另外设立了一个生化与分子生物学诺贝尔奖 生物化学技术与分子生物学技术 生物化学技术 分子的分离纯化鉴定定量包括分光 层析 电泳 离心 超滤等分子生物学技术 基因 分子水平的系列操作 把生化 微生物免疫等技术相结合形成系统 包括PCR技术 基因克隆表达技术 分子杂交印迹 单克隆抗体技术 RNAi技术 基因敲除 基因诊断与基因治疗 芯片技术 mRNA差异显示技术等 得到高质量的符合要求的研究材料是进行分子生物学研究面临的首要问题 也是关键性的第一步对特定生物分子进行定性 定量分析是最常用的研究策略 层析技术 电泳技术 分光技术 离心技术 一 常用生化分离纯化技术 1 层析技术 基本原理层析系统都由互不相溶的两相溶剂 固定相和流动相 组成 利用样品各组分的物理化学性质的差异 使待分离的各组分以不同程度分布在两相中 以不同速度随流动相移动 最终达到分离目的 在一定温度下达到平衡后 某种溶质在两相中的浓度比是个常数 称分配系数 KD 它是物种的特征常数之一 溶质在固定相中浓度KD 溶质在流动相中浓度 系统组成 固定相 介质 惰性支持物流动相 展层剂 常见层析技术类型 按原理分吸附层析分配层析吸附分配层析离子交换层析分子筛层析 凝胶层析 亲和层析共价层析 按装置分柱层析薄层层析纸层析液相层析高效液相层析 色谱 HPLC 气相色谱 通常把原理 装置和固定相结合起来命名 DEAE纤维素柱层析活性碳吸附柱层析琼脂糖凝胶层析 分辨率与分离效率 分辨率以层析系统的溶剂体积相对溶质浓度作图 相邻两峰的分开程度称为分辨率 分辨率反映了分离的效果 装置的形状尺寸 例如柱层析中柱的长度 直径 以及物质的分配系数均影响分辨率 分配系数差异越大 则分离峰相距愈远 分辨率越高 对柱层析而言 柱越长越细 分辨率越高 分离效率单位时间内分离溶质的量称分离效率 对柱层析来说称柱效率 分配系数差异越大 柱越短越粗 分辨率越高 柱层析 梯度混合器 固定相不同原理不同 吸附层析 吸附力差异活性炭 硅藻土 纤维素 氧化铝分配层析 分配系数 溶解度 差异滤纸离子交换层析 极性差异离子交换树脂 羧甲基纤维素CM DEAE分子筛层析 凝胶层析 分子大小葡聚糖Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose亲和层析 专一吸附力 配基或配体 受体 薄层层析与纸层析 展层时分配系数不同的溶质在薄层板上移动速率不同而得到分离用于小分子分离分析原点到层析点中心的距离迁移率Rf 原点到溶剂前沿的距离 萃取与分配层析不同 甲乙物质在固定相A 流动相B中分配系数不同 2 0 5 甲 乙 高效液相层析 HPLC利用高压泵产生的高压力驱动流动相流过色谱柱很高的柱效率 分辨率 有高压 高速 高灵敏度 易自动化等特点 灵敏度高达10 9g 紫外检测 甚至10 11g 荧光检测 2 电泳技术 带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动 称为电泳 电泳技术依据生物分子在溶液中带电性质及分子大小 形状有差别 从而在电场中的迁移率不同而将其分离纯化 分类 按支持介质的不同可分为 醋酸纤维薄膜电泳 CelluloseAcetateelectrophoresis 琼脂凝胶电泳 AgarGelelectrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶 PolyacrylamideGelelectrophoresis PAGE 等电聚焦电泳按支持介质形状不同可分为 薄层电泳 板电泳 水平 垂直 柱电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺电泳 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和N N 甲叉双丙烯酰胺在加速剂和催化剂 四甲基乙二胺 TEMED 作用下交联成三维网状结构的凝胶 具有如下优点 1 一定浓度下 凝胶透明 有弹性 机械性能好2 化学性能稳定 与被分离物不起化学反应3 对pH和温度变化较稳定4 几乎无电渗作用 样品分离重复性较好5 样品不易扩散 用量少 灵敏度可达10 6g6 凝胶孔径可调节7 分辨率高 尤其在不连续凝胶电泳中 等电聚焦电泳 不同物质由于带电性质不同 因而在一定的电场强度下移动的方向和速度不同 可以进行分离 蛋白质具有许多可解离的酸性基团 COOH 和碱性基团 NH2 及其它基团 在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团 当蛋白质溶液处于某一pH时 蛋白质解离成正 负离子的趋势相等 成为兼性离子 净电位为零 此时溶液的pH称为蛋白质的等电点 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物 两性电解质 Ampholine 在支持物内形成稳定的pH梯度 当蛋白质在电场力的作用下 便会在支持物中运动到相当于自身pH梯度中聚合成一狭窄的区带而停留 因为Ampholine形成的pH梯度是一较平滑的稳定的pH梯度 从理论上讲 只要蛋白质的pI相差0 01就可分离 血红蛋白的pI约在6 9 细胞色素C的pI为10 5 两者的pI相差较大 可以得到较好的分离 特点 与化学产品的分离制备相比较 生物大分子的制备有以下主要特点 生物材料的组成极其复杂 常常包含有数百种乃至几千种化合物 许多生物大分子在生物材料中的含量极微 分离纯化的步骤繁多 流程长 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活 因此分离过程中如何防止其失活 就是生物大分子提取制备最困难之处 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的 温度 pH值 离子强度等各种影响参数对溶液中各种组成的综合影响 很难准确估计和判断 二 生物大分子分离纯化的操作 一 破碎 裂解细胞1 动物组织 新鲜组织直接在冰上研磨 较坚韧的组织匀浆 冻存组织和对核酸完整性要求高的组织用液氮研磨 加入细胞裂解液 含蛋白酶K或胍盐 去垢剂SDS或TWEEN EDTA Tris缓冲液 二巯基乙醇等 2 动物培养细胞 动物血细胞 离心收集 PBS洗涤 加入细胞裂解液3 植物组织 霉菌 真菌 石英玻璃砂或氧化铝研磨 对完整性要求高的材料要加入液氮研磨 再加入裂解液4 细菌 溶菌酶 超声波 去垢剂 SDS 等 二 基因组DNA制备1 破碎 裂解细胞 胍 SDS等 2 除蛋白 组织碎片 离心 酚氯仿抽提3 除RNA RNase 不含DNase或50 C处理 4 除盐等小分子 乙醇沉淀 12000rpm以上离心5 进一步纯化 除痕量蛋白等杂质 蛋白酶K 酚氯仿抽提 柱层析 密度梯度超离心注意 防DNase的破坏 温度控制 冰浴或500CEDTA螯合二价离子防机械剪切力 三 总RNA1 破碎细胞 胍 酚等变性剂 注意缩短组织匀浆时间2 除核蛋白 低盐 离心3 除少量DNA 不含RNase的DNase4 除多糖 12000rpm以上离心5 除盐等小分子 乙醇沉淀6 进一步纯化 除痕量蛋白等杂质 蛋白酶K 酚氯仿抽提 柱层析注意 防RNase RNasin 专一抑制剂 蛋白 DEPC处理水 浸泡 1200C消毒 1800C烤器皿胍盐中储存氧钒核苷复合物 较难除去 紫外分光法原理 在260nm下 核酸 DNA RNA 有最大吸收 这是由它们含有的嘌呤环和嘧啶环的共扼双键系统的特性所决定的 通常每毫升1微克的DNA钠盐溶液的光密度为0 020 每毫升1微克的RNA钠盐溶液的光密度为0 025 所以核酸浓度与光密度值有以下关系 dsDNA ug ml OD260 50ssDNA ug ml OD260 37RNA ug ml OD260 40OD260 OD280在1 8 2 2内核酸样品比较纯 总量定量 鉴别方法DNARNAPROTEIN化学法二苯胺法苔黑酚法双缩脲 Folin酚 染色 凯氏定氮 不需纯化 物理法UV260UV260UV280电泳法电泳法电泳法 四 质粒载体 1 破碎细胞 NaOH SDS等变性剂2 除核蛋白 低盐 离心3 除少量RNA 不含DNase的RNase4 除多糖 12000rpm以上离心5 除盐等小分子 乙醇沉淀6 进一步纯化 除痕量蛋白等杂质 酚氯仿抽提 柱层析 旋转柱层析 梯度离心注意 防开环 断开污染核DNA片段 12345 2为质粒 可见2种构型 3为单酶切质粒1 5为MARKER 构型 超螺旋线状开环 五 特殊要求的核酸分子分离纯化方法 分离特定长度的DNA如获得目的基因 探针 PCR产物回收 酶切后的克隆载体1 电泳洗脱法高分辨 普通琼脂糖有杂质 用高纯度或低熔点电泳挖孔法琼脂糖 或胶回收试剂盒2 密度梯度离心法 常用介质有甘油 蔗糖 氯化铯 昂贵 密度梯度仪不同长度DNA停留在离心管不同高度经密度梯度离心 样品纯度极高3 柱层析与旋转柱层析 Sephadex G50 去除很短核酸片段和dNTP 纯化探针各种提取 浓缩 分子量截留试剂盒 五 总蛋白质的分离纯化方法 1 破细胞SDS等 超声波 低温研磨或匀浆 酶法2 利用溶解度的特点 调节pH 离子浓度等使蛋白质溶解 离心3 分级盐析常用 NH4 2SO44 相分配法使蛋白与核酸分开 低盐条件下蛋白与核蛋白分开 再调到到4MNaCl 则蛋白质在上相 核酸在下相 5 柱层析进一步纯化6 透析除盐 小分子试剂盒 生化分子生物学技术在医药学中应用举例 一 PCR技术 DNA片段扩增技术1 基因诊断 分子病理 医 临床用于检测传染病的病染体 遗传病的变异基因 肿瘤的癌基因与抗癌基因 测定某疾病相关基因表达水平等2 物种鉴定 分子药理 药 中药学上应用随机引物PCR DNA指纹法 DNA多态性分析 rRNA间隔区长度法分析进行昂贵地道药材的鉴定研究药物对疾病相关基因表达的影响 RT PCR mRNA逆转录为cDNA以cDNA为模板进行目标片段的扩增 第一步 获得模板 待检测对象的细胞内核酸 DNA RNA 二 基因克隆技术 重组DNA技术 医药领域的应用 1 基因工程制药 干扰素 胰岛素 免疫因子 生长因子抗菌肽 凝血因子 乙肝疫苗 秋水仙酰胺 蛇毒等 2 基因治疗肿瘤 抗癌基因 自杀基因 免疫因子 血管生长抑制因子等 第一步 分离提纯带有目的基因的基因组DNA RNA或重组载体 以及提纯表达目的基因所需要的载体 克隆的载体 一 质粒 粘粒 COS 质粒 染色体外共价闭环双链小分子DNA 特点 1 自我复制能力2 松弛型 高拷贝严谨型 低拷贝3 抗性标记4 插入失活二 噬菌体 三 病毒 三 分子杂交与印迹技术 一 分子杂交DNA或RNA的单链分子之间如果存在一定程度的碱基互补配对关系 一定条件下就可以在不同的分子间形成杂化双链 二 杂交印渍技术 Dot slotblottingSouthernblottingNorthernblottingWesternblotting电泳分离 特异分子显示 杂交探针 Ag Ab反应 可用于特异DNA RNA 蛋白质的定性定量检测 凝胶电泳 使核酸单链转移到硝酸纤维素膜 NC 毛细管作用电转移真空吸引 与标记探针进行杂交或抗原抗体反应 显色或暴光 目标显出区带 定量 提纯 1 Dot slotblotting 特异DNA RNA分子通过与标记探针杂交而显示出来 再定量 2 Southernblotting 1 基因组DNA的结构分析 2 特异基因的突变分析 应用 探针标记技术 用同位素 生物素 地高辛或荧光染料标记末端或全链 3 RNA印渍技术 Northernblotting 原理同Southernblotting 但不需要酶切可直接进行变性电泳 转移 可用RT Southernblotting取代应用 检测特异基因表达水平 Northernblotting RNA变性凝胶电泳 使RNA转移到硝酸纤维素膜 NC 毛细管作用电转移真空吸引 与探针进行杂交 放射自显影 显出杂交区带 RNA提纯 4 蛋白质的印渍分析 蛋白质变性 电泳 转移到NC膜上 加入抗体 加入标记的二抗 显示区带 检测分析 免疫印迹 Westernblotting 提取总蛋白质 SOUTHERNBLOTDNA电泳与DOTBLOT结合NORTHERNBLOTRNA电泳与DOTBLOT结合WESTERNBLOT蛋白质电泳与免疫组化结合 特异mRNA 蛋白质定量方法 研究信号传递 基因表达调控 基因表达谱需要对重要的功能蛋白或受体及其mRNA进行分离 纯化 定量 对特异mRNA进行定量方法1 mRNA原位杂交2 RT PCR3 northernblot dotblot slotblot对特异蛋白或受体进行定量方法 1 免疫组化2 生物活性检测3 westernblot 生物大分子分离纯化鉴定定量技术路线的选择 高质量的原则经济的原则 应用举例 1 PCR检测PCR定性 纯度要求低 允许部分降解PCR指数放大极灵敏 要严防样品交叉污染 裂解 离心 简单的纯化 胍酚或酚氯仿一步法 PCR定量 灵敏度高严防污染 降解 严防试管效应模板要求较纯 较完整 需纯化 SOUTHERNBLOTNORTHERNBLOT DOTBLOT WESTERNBLOT防降解纯度 完整性要求低于RT PCR 灵敏度低 可靠性高 RT PCR定量特定mRNA 灵敏度高 可靠性低严防污染 降解 试管效应RNA要求较纯 较完整 不需纯化 DNA原位杂交RNA原位杂交免疫组化 测生物活性防降解不能定量 除活性测定 可靠性高 2 特定分子的定量 四 基因表达干预 1 反义核酸技术用反义DNA 反义脱氧寡核苷酸 反义RNA 与相应DNA有意义链 mRNA结合 阻抑从DNA到mRNA到蛋白质整个表达过程 反义寡核苷酸可与相应DNA高嘌呤区域的双螺旋结合 形成三链 封闭RNA聚合酶而抑制转录 被称为三链技术 2 核酶技术是一种特殊的反义RNA 但它除了封闭基因表达外还有催化作用 可与互补的mRNA结合然后把它切割 切割不断反复进行 从而破坏翻译的模板 抑制靶基因表达 3 RNAi RNAinterference 技术一般是指利用与靶基因互补的双链RNA片段抑制阻断靶基因表达 RNAi RNAinterference 技术产生 1998年 Fire等发现双链RNA对同源靶基因表达的特异阻抑效应比单链反义RNA 单链有意义RNA强得多 把这种作用的双链RNA片段命名为RNAi 较长的RNAi可诱发干扰素系统和非特异阻抑效应 造成广泛的转录后基因沉默效应 PTGS 对哺乳动物来说 大于30bpRNAi就可产生非特异效应 所以用于人类基因治疗的RNAi小于30bp RNAi诱导PTGS的原理 小分子量的RNA片段ds