《蛋白质的测定》PPT课件.ppt

第九章蛋白质的测定 王建龙食品科学与工程学院 第九章重点 凯氏定氮法原理 分步 测定方法 双缩脲法测定原理 氨基酸总量的测定方法 甲醛滴定法 一 概述1 食品中的蛋白质含量 各种不同食品的蛋白质含量各不相同 一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品 食品中的蛋白质含量 g 100g 牛肉猪肉兔肉鸡肉209 52120大豆米面粉菠菜苹果408 5102 40 4 2 蛋白质的生理功用及在食品中的作用 构成人体的重要成分 构成体内多种具有重要生理功能的物质 参与调节和维持体内的酸碱平衡及胶体渗透压 参与神经冲动的传导 思维活动和遗传信息的传递 提供能量 食品的重要营养指标 3 蛋白质系数 蛋白质是复杂的含氮有机化合物 一般蛋白质含氮量为16 即一份氮素相当于6 25份蛋白质 此数值 6 25 称为蛋白质系数 不同种类食品的蛋白质系数有所不同 二 测定方法 蛋白质测定方法 凯氏定氮法 蛋白质快速测定法 一 凯氏定氮法 GB T5009 5 2003 凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量 由于样品中含有少量非蛋白质 用凯氏定氮法通过测总氮量来确定蛋白质含量 包含了核酸 生物碱 含氮类脂 卟啉 以及含氮色素等非氮蛋白质含氮化合物 所以这样的测定结果称为粗蛋白 TheKjeldahlProcedure凯氏法的程序 1 Digestionstep消化2 Distillationstep蒸馏3 Titrationstep滴定 1 原理2NH2 CH2 2COOH 13H2SO4 NH4 2SO4 6CO2 12SO2 16H2O消化 NH4 2SO4 2NaOH 2NH3 Na2SO4 2H2O蒸馏 浓硫酸具有脱水性 使有机物脱水后被炭化为碳 氢 氮 浓硫酸又具有氧化性 将有机物炭化后的碳化为二氧化碳 硫酸则被还原成二氧化硫 2H2SO4 C 2SO2 2H2O CO2 2 仪器凯氏烧瓶 可调式电炉 蒸汽蒸馏装置 3 试剂 1 硫酸铜 CuSO4 5H2O 2 硫酸钾 3 浓硫酸 密度为1 8419g L 4 氢氧化钠溶液 400g L 5 硼酸溶液 20g L 6 0 05mol L盐酸标准滴定溶液 7 95 乙醇 8 混合指示液 1份甲基红乙醇溶液 1g L 与5份溴甲酚绿乙醇溶液 1g L 临用时混合 也可用2份甲基红乙醇溶液 1g L 与1份亚甲基蓝乙醇溶液 1g L 临用时混合 甲基红 溴甲酚绿pH5 0以下为暗红色 pH5 1为灰绿色 pH5 2以上为绿色 甲基红 亚甲基蓝混合指示液 变色点pH 5 4 5 2 红紫 5 4 灰蓝 5 6 绿 4 操作方法样品消化 蒸馏 滴定 1 样品消化 样品 0 2g硫酸铜 6g硫酸钾 20ml浓硫酸 玻珠数粒 先小火炭化 无泡沫后 加大火力 液体变蓝绿透明 继续加热微沸30分钟 45度角 消化终点 瓶口不能对着人 盖上小漏斗 2 蒸馏 按下图连接好蒸馏装置图 加水至2 3体积处 加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升 使水呈酸性 夹紧螺旋夹 加热蒸汽发生瓶中的水 检查整套装置是否有漏气现象 不能漏气 水蒸气与生成的氨气共沸 不断移除氨气 使反应继续 2 蒸馏 将消化液全部转移到100ml容量瓶中 加10ml硼酸溶液和混合指示剂2 3d 加入NaOH溶液后颜色为深蓝色或褐色 通入蒸汽开始蒸馏 冷凝管下口浸入硼酸溶液中 取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室 少量蒸馏水冲洗 塞紧棒状玻璃塞 向小玻璃杯内加入10ml40 NaOH 提起玻璃塞 使NaOH缓慢流入反应室 立即塞紧玻璃塞 并在小玻璃杯中加水使之密封 吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟 将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min 用蒸馏水冲洗冷凝管尖端 取下接收瓶 关闭电源 3 滴定取下接收瓶 用0 1000mol L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点 滴定前 滴定终点 同时做一试剂空白实验 记录空白滴定消耗盐酸的体积 5 计算 0 014表示1 0盐酸标准滴定溶液相当氮的含量F表示蛋白质系数计算结果保留三位有效数字 6 说明及注意事项 1 试剂溶液应用无氨蒸馏水配制 2 消化时不要用强火 应保持缓和沸腾 消化中不时转动凯氏烧瓶 以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固体残渣 促进其消化完全 3 为加速消化 常加入硫酸钾 可提高消化体系溶液温度硫酸铜 催化剂 消化终点指示剂 蒸馏时碱性反应指示剂 硫酸钾的作用 加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解 它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度其反应式如下 K2SO4 H2SO4 2KHSO42KHSO4 K2SO4 H2O SO3一般纯硫酸的沸点在340摄氏度左右 而添加硫酸钾后 可使温度提高到4000C以上 原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解 水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大 故沸点升高 但硫酸钾加入量不能太大 否则消化体系温度过高 又会引起已生成的铵盐发生热分解而造成损失 NH4 2SO4 NH3 NH4 HSO42 NH4 HSO4 2NH3 2SO3 2H2O 硫酸铜的作用 催化剂2CuSO4 CuSO4 SO2 O2CO2 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 O2 Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 2H2O SO2 此反应不断进行 待有机物被消化完后 不再有硫酸亚铜 褐色 生成 溶液呈现清澈的蓝绿色 可以指示消化终点的到达 下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂 4 样品中若含较多脂肪或糖 在开始消化时应用小火加热 并时时摇动 或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂 并同时注意控制热源强度 5 当样品消化液不易澄清透明时 可将凯氏烧瓶冷却 加入30 过氧化氢2 3ml后再继续加热消化 6 若取样量较大 如干试样超过5g 可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量 7 一般消化至呈透明后 继续消化30分钟即可 一般消化时间约4小时 时间延长可能引起氨的损失 有机物如分解完全 消化液呈蓝色或浅绿色 但含铁量多时 呈较深绿色 8 蒸馏装置不能漏气 9 蒸馏前若加碱量不足 消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀 需再增加氢氧化钠用量 10 硼酸吸收液的温度不应超过40 否则对氨的吸收作用减弱 置于冷水浴中使用 11 蒸馏完毕后 应先将冷凝管下端提离液面 清洗管口 再蒸1分钟后关掉热源 否则可能造成吸收液倒吸 7 自动凯氏定氮仪法在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法 具有安全 高效 准确的优点 仪器 消化炉 自动蒸馏装置 FOSS产品线 化学分析仪器 化学分析类仪器 Kjeltec系列定氮仪 FOSS产品线 化学分析仪器 化学分析类仪器 Tecator系列消化器 2005年秋季新产品 DigestionBlocks消化炉 Auto20andAuto8250 400ml 和100ml Basic20andBasic8250 400ml和100ml New Auto40100ml Lift ExhaustManifoldandScrubber消化炉 升降装置 排废罩和涤气装置 NewgenerationofKjeltecSystems新一代凯氏定氮仪 前所未有的智能化系统 8200 8400 半自动 到 全自动 8100 8400 8420或8460 New KjeltecTM8100凯氏定氮仪 自动添加稀释液和碱 自动进行蒸馏和结束蒸馏 自动进行消化管排空 操作简便 专利的SAfE 技术保证在消化管中有酸 盐结晶时的安全蒸馏 内置的安全系统保证操作者的安全 馏出液的温度控制系统保证分析结果准确可靠 风箱泵精确添加试剂 保证准确性 KjeltecTM8200凯氏定氮仪 包含KjeltecTM8100所有的特征 另加 自动添加接收液自动安全门可增加模块升级到全自动凯氏定氮仪 KjeltecTM8400全自动凯氏定氮仪 包括KjeltecTM8200的所有特征 外加 滴定 计算和报告 可升级和20或60位自动进样器连用 进行无人值守的全自动化操作 局域网连接方式能够和打印机及天平进行无障碍连接 彩色触摸屏 通过可选计算机数据管理软件Compass实现完全由计算机控制样品注册和报告 KjeltecTM8420自动进样器 20位自动进样器 可容纳一个20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系统将消化管架直接装入进样器 不需要转移消化管或消化好的样品 KjeltecTM8460自动进样器 60位自动进样器 可容纳3个20位消化管架250ml和400ml消化管都可用于系统将消化管架直接装入进样器 不需要转移消化管或消化好的样品 KjeltecTM自动进样器 可选20 60位进样器直接将消化管架放入 不需转移消化管或转移样品250ml和400ml管都可用于系统Kjeltec8400自动定氮仪可以直接升级Kjeltec8200也可以升级到加进样器的分析系统 Kjeltec8420 Kjeltec8460 其它厂家的不能升级或不能直接升级连接进样器 且需转移消化管或消化管内的样品 仪器性能 测量范围 0 1 200mgN检测时间 30mgN用时3 5分钟 200mgN用时6 5分钟回收率 99 5 1 200mgN范围重现性 RSD1 滴定器精度 2 4ul 步试剂泵体积 0 150ml 10ml步进数据存储 单机40个批次 800个数据 Compass软件无限进样器 20位 60位 二 蛋白质快速测定法 双缩脲法紫外分光光度法染料结合法水杨酸比色法 1 双缩脲法 1 反应原理1 原理当脲被小心地加热至150 160 时 可由两个分子间脱去一个氨分子而生成二缩脲 也叫双缩脲 反应如下 双缩脲与碱及少量硫酸铜溶液作用生成紫红色的配合物 此反应称为双缩脲反应 2 方法特点及应用范围 由于蛋白质分子中含有肽键 CO NH 与双缩脲结构相似 故也能呈现此反应而生成紫红色配合物 在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比 据此可用吸收光度法来测定蛋白质含量 该配合物的最大吸收波长为560nm本法灵敏度较低 但操作简单快速 故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法 本法亦适用于豆类 油料 米谷等作物种子及肉类等样品测定 3 操作方法 标准曲线的制作 按蛋白质含量40mg 50mg 60mg 70mg 80mg 90mg 100mg 110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质 8支50mL纳氏比色管中 各加入1mL四氯化碳 用碱性硫酸铜溶液准确稀释至50mL 振摇10min 静置1h 取上层清液离心5min 取离心分离后的透明液于比色皿中 以蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定各溶液的吸光度A 560nm波长 蛋白质的含量为横坐标 吸光度A为纵坐标绘制标准曲线 以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样 样品的测定 准确称取样品适量 即使得蛋白质含量在40 110mg之间 于50mL纳氏比色管中 加1mL四氯化碳 按上述步骤显色后 在相同条件下测其吸光度A 用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数 进而由此求得样品中的蛋白质含量 4 结果计算 式中c 由标准曲线上查得的蛋白质质量 mg m 样品质量 g 5 说明及注意事项 蛋白质的种类不同 对发色程度影响不大 标准曲线制作完整后 无需每次再作标准曲线 含脂肪高的样品应预先用醚抽出弃去 样品中有不溶性成分存在时 会给比色测定带来困难 此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定 当肽链中含有脯氨酸时 若有多量糖类共存 则显色不好 会使测定值偏低 碱性硫酸铜溶液由0 1mol氢氧化钾 5g酒石酸钾钠 1 6g硫酸铜溶于水后加水至1000mL配成 2 福林 酚比色法 原理蛋白质 或多肽 分子中含有酪氨酸或色氨酸 能与Folin 酚试剂起氧化还原反应 生成蓝色化合物 蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比 可用比色法测定蛋白质浓度 是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一 测定吸取一定量的样品稀释液 加入试剂甲 置于25 中水浴保温10min 再加入试剂乙 立即混匀 保温30min 以介质溶液调零 测定A750nm值 与蛋白质标准液作对照 求出样品的蛋白质的含量 本法在0 60mg L蛋白质范围呈良好线性关系 3 考马斯亮蓝染料比色法 原理考马斯亮蓝G 250是一种蛋白质染料 与蛋白质通过范德华引力结合 使蛋白质染色 在620nm处有最大吸收值 可用于蛋白质的定量测定 此法简单而快速 适合大量样品的测定 灵敏度与福林酚法相似 但不受酚类 游离氨基酸和小分子的影响 测定吸取样品稀释液2mL 加染料试剂2mL 混匀 以介质溶液调零 测定A620nm 与蛋白质标准溶液对照 求出样品蛋白质含量 本法在0 100mg L蛋白质范围内呈良好的线性关系 氨基酸态氮的测定 双指示剂甲醛滴定法 原理 试剂 测定方法 结果计算 说明 电位滴定法 原理 试剂 仪器 测定方法 结果计算 三 氨基酸态氮的测定 1 双指示剂甲醛滴定法原理氨基酸具有酸性的 COOH基和碱性的 NH2基 它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐 当加入甲醛溶液时 NH2基与甲醛结合 从而使其碱性消失 这样就可以用强碱标准溶液来滴定 COOH基 并用间接的方法测定氨基酸的总量 R C H H3N C C O R C C OH O H NH2 HCHO R C COOH H NCH2 NaOH 2 操作方法移取含氨基酸约20 30mg的样品溶液2份 分别置于250ml锥形瓶中 各加50ml蒸馏水 其中1份加入3滴中性红指示剂 用0 1mol L氢氧化钠标准溶液滴定至由红变为琥珀色为终点 另1份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20ml 摇匀 静置1分钟 用0 1ml L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点 分别纪录两次所消耗的碱液ml数 式中c 氢氧化钠标准溶液的浓度 mol L V1 用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积 mL V2 用