e5本操作程序》课件(新人教版选修3).ppt

1 2基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 目的基因的获取 基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 操作过程 目的基因的检测与鉴定 一 为什么要有 目的基因的获取 这一步 二 为什么要有 表达载体的构建 这一步 有了目的基因 我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性 单独的DNA片段 目的基因是不能稳定遗传的 构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能表达和发挥作用 三 为什么要有 目的基因导入受体细胞 这一步 四 为什么要有 目的基因的检测与鉴定 这一步 含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞 并且维持稳定和表达 才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化 因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达 只有通过检测 鉴定才能得知 编码区上游 编码区下游 RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶结合位点 编码蛋白质 调控 调控 原核细胞 真核细胞 真核细胞 目的基因主要是指 编码蛋白质的结构基因 目的基因的获取 即 将需要的基因从供体生物细胞内提取出来 目前被广泛提取使用的目的基因有 苏云金杆菌抗虫基因 植物抗病基因 抗病毒 抗细菌 人胰岛素基因等 一 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 1 基因文库 基因组文库与部分基因文库的关系 2 基因文库的构建方法 鸟枪法 供体细胞中的DNA 许多DNA片段 运载体 限制酶 与载体连接载入 受体细胞 产生特定性状 导入 外源DNA扩增 目的基因 分离 直接分离法 一 从基因文库中获取目的基因 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 目的基因的mRNA 杂交双链 单链RNA 单链DNA 单链DNA 反转录酶 核酸酶H DNA聚合酶 双链DNA 目的基因 根据已知的氨基酸序列合成DNA法 根据已知蛋白质的氨基酸序列 推测出相应的信使RNA序列 然后按照碱基互补配对原则 推测出它的结构基因的核苷酸序列 再通过化学方法 以单核苷酸为原料合成目的基因 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 2 基因文库的构建方法 二 利用PCR技术扩增目的基因 1 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 2 原理 选修1P10 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 二 利用PCR技术扩增目的基因 3 过程 DNA双链复制的基本原理 PCR技术 聚合酶链式反应 原理 前提 条件 PCR扩增仪 一段已知目的基因的核苷酸序列 四种脱氧核苷酸 一对引物 热稳定DNA聚合酶 Taq酶 DNA的两条链为模板 温度控制 PCR 聚合酶链式反应 技术扩增 由穆里斯等人于1988年发明 并于1993年获得若贝尔化学奖 PCR反应的过程 变性 退火 延伸 多次重复 结果 双链DNA分子数为2n 可获取大量目的基因 3 过程 a DNA变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 退火 复性55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 引物延伸 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 1 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 2 原理 4 方式 以 方式扩增 即 n为扩增循环的次数 5 结果 聚合酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA复制 指数 2n 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增 二 利用PCR技术扩增目的基因 3 过程 变性 退火 延伸 点点生物学教学 寻根问底 1 为什么要构建基因文库 直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗 提示 构建基因文库是获取目的基因的方法之一 并不是惟一的方式 如果所需要的目的基因序列已知 就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中 直接获得 也可以通过反转录 用PCR方式从mRNA中获得 不一定要构建基因文库 但如果所需要的目的基因的序列完全不知 或只知道目的基因序列的一段 或想从一种生物体内获得许多基因 或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同 或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同 或者想得到一种生物的全基因组序列 往往就需要构建基因文库 1 用一定的 切割质粒 使其出现一个切口 露出 2 用 切断目的基因 使其产生 核心 3 将切下的目的基因片段插入质粒的 处 再加入适量 形成了一个重组DNA分子 重组质粒 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 二 基因表达载体的构建 基因表达载体的构建 核心 质粒 DNA分子 一个切口两个黏性末端 两个切口获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种限制酶 目的基因与运载体的结合过程 实际上是不同来源的基因重组的过程 基因表达载体的组成 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 编码区上游 编码区下游 RNA聚合酶结合位点 RNA聚合酶结合位点 编码蛋白质 调控 调控 原核细胞 真核细胞 真核细胞 1 启动子 一段有特殊结构的DNA片段 位于基因的首端 是RNA聚合酶识别和结合的部位 驱动基因转录 2 终止子 一段有特殊结构的DNA片段 位于基因的尾部 起终止转录的作用 三 将目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞 动植物细胞 大肠杆菌 土壤农杆菌 枯草杆菌等 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 方法 导入植物细胞 导入动物细胞 导入微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 显微注射法 感受态细胞吸收DNA分子 三 将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入 内 并且在受体细胞内维持 和 的过程 受体细胞 稳定 表达 在金属微粒上涂一层目的基因 然后发射到宿主细胞中 利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞 四 目的基因的检测与鉴定 检查是否成功 检测 鉴定 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 方法 方法 DNA分子杂交 DNA分子杂交 抗原 抗体杂交 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段 将两种生物的DNA分子的单链放在一起 如果这两个单链具有互补的碱基序列 那么 互补的碱基序列就会结合在一起 形成杂合双链区 在没有互补碱基序列的部位 仍然是两条游离的单链 P15思考与探究 2 微生物作受体细胞原因 将目的基因导入微生物细胞 3 转化方法 大肠杆菌 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 处理细胞 细胞 表达载体与感受态细胞混合 细胞吸收DNA分子 Ca2 感受态 感受态 1 常用菌 目的基因插入Ti质粒的T DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 Ti质粒的T DNA可转移至受体细胞的染色体上 2 转化 如果显示出杂交带 就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录 1 下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容 正确的组合是 2 下列属于获取目的基因的方法的是 利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A B C D 3 细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因 该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A 提高受体细胞在自然环境中的耐药性B 有利于对目的基因是否导入进行检测C 增加质粒分子的分子量D 便于与外源基因连接4 有关基因工程的叙述正确的是 A 限制酶只在获得目的基因时才用B 重组质粒的形成是在细胞内完成的C 质粒都可作为运载体D 蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 5 哪项不是基因表达载体的组成部分 A 启动子B 终止密码C 标记基因D 目的基因6 下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法 A 基因枪法B 显微注射法C 农杆菌转化法D 花粉管通道法 胰岛素是治疗糖尿病的特效药 长期以来只能依靠从猪 牛等动物的胰腺中提取 100Kg胰腺只能提取4 5g的胰岛素 其产量之低和价格之高可想而知 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素 想一想 如何设计 尝试设计 1 作为基因工程表达载体 只需含有目的基因就可以完成任务吗 为什么 答 不可以 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用 还需要有其他控制元件 如启动子 终止子和标记基因等 必须构建上述元件的主要理由是 1 生物之间进行基因交流 只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达 2 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子 只将编码序列导入受体生物中无法转录 3 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记 4 为了增强目的基因的表达水平 往往还要增加一些其他调控元件 如增强子等 5 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位 往往要加上可以标识存在部位的基因 或做成目的基因与标识基因的融合基因 如绿色荧光蛋白基因等 点点生物学教学 2 根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理 你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗 若将一个抗病基因导入小麦中 理论上讲你应该怎样做 要选择合适的农杆菌菌株 因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物 要加趋化和诱导的物质 一般为乙酰丁香酮等 目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢 趋化性 和激活农杆菌的Vir区 诱导 的基因 使T DNA转移并插入到染色体DNA上 3 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素 联系前面有关细胞器功能的知识 结合基因工程操作程序的基本思路 思考一下 若要生产人的糖蛋白 可以用大肠杆菌吗 提示 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链 这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的 内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中 大肠杆菌不存在这两种细胞器 因此 在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的 4 珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分 当它的成分异常时 动物有可能患某种疾病 如镰刀形细胞贫血症 假如让你用基因工程的方法 使大肠杆菌生产出鼠的 珠蛋白 想一想 应如何进行设计 提示 基本操作如下 1 从小鼠中克隆出 珠蛋白基因的编码序列 cDNA 2 将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子 另外加上抗四环素的基因 构建成一个表达载体 3 将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中 然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌 如果表达载体未进入大肠杆菌中 大肠杆菌会因不含有抗四环