石斛中多糖含量的测定

精品文档 1欢迎下载 题 目 石斛中多糖含量的测定 学生姓名 高 换 楼 学号 1111034082 所在学院 化学与环境科学学院 专业班级 化工 1102 班 指导教师 季 晓 晖 完成地点 陕西理工学院 2015 年 06 月 08 日 精品文档 2欢迎下载 石斛中多糖含量的测定 高换楼 陕西理工学院 化学与环境科学学院 化工专业 1102 班 陕西 汉中 723001 季晓晖 摘要 石斛为我国常用贵重药材 有养阴清热 益胃生津的功效 石斛一直备受国内外研究者的重视 本 文利用蒽酮 硫酸法对铁皮石斛多糖的含量进行了测定 并采用正交试验得到最佳实验方案 在石斛粉碎程度为粉 末 液料比为 50mL g 提取 2 次 每次 3 小时的情况下多糖提取率最高 本文的实验结果为今后铁皮石斛多糖提取 的质量评价及其进一步开发和利用提供参考依据 关键词 石斛 多糖 蒽酮 硫酸法 抗氧化性 测定 DeterminationDetermination ofof DendrobiumDendrobium polysaccharidepolysaccharide contentcontent GAO Huanlou Grade 02 Class 11 Major chemical engineering School of chemical and environmental science Dept Shaanxi University of Technology Hanzhong 72300 x Shaanxi Tutor JI Xiaohui Abstract Abstract Dendrobium is in common use in our country precious medicinal herbs the effect of nourishing yin and clearing heat nourishing stomach fluid Dendrobium has attracted a lot of attention of researchers at home and abroad The anthrone sulfuric acid method of Dendrobium officinale polysaccharide content were measured and using the orthogonal test and the optimum solution is obtained In Dendrobium degree of comminution is in the form of powder liquid to solid ratio for 50mL 1g extraction 2 times every time 3 hours of polysaccharides extraction rate was the highest The experimental results for the quality evaluation of future Dendrobium officinale polysaccharide extraction and its further development and utilization to provide reference KeyKey words words Dendrobium polysaccharide anthrone sulfuric acid method antioxidation determination 精品文档 3欢迎下载 目录 1 论文综述 1 1 1 石斛生物碱 1 1 2 石斛多糖 1 1 3 铁皮石斛的其他化学成分 3 1 3 1 氨基酸类 5 1 3 2 微量元素 5 1 3 3 木脂素类 5 1 3 4 酚酸类 5 1 3 5 苯丙素类 6 1 3 6 芪类其衍生物 6 1 3 7 菲类和联苄类化合物 7 1 4 石斛的药理作用 7 1 4 1 增强机体免疫作用 7 1 4 2 抗氧化作用 7 1 4 3 抗肿瘤作用 7 1 4 4 抗疲劳作用 8 1 4 5 降血糖作用 8 1 4 6 生津作用 8 1 4 7 其他药理作用 8 2 实验 8 2 1 材料和试剂 仪器 8 2 1 1 仪器 8 2 1 2 材料及试剂 9 2 2 试验方法 9 2 2 1 预处理与纯化过程 9 2 2 2 样品制备及试剂配制 9 2 2 3 测定 9 2 2 4 铁皮石斛多糖抗氧化性测定 10 2 2 5 多糖提取的正交试验 10 2 2 3 计算 11 2 2 5 结果与分析 11 3 结论 13 4 外文翻译 17 精品文档 1欢迎下载 1 论文综述 石斛是我国传统常用名贵中药材 为兰科 Orchidaceae 石斛属 DendrobiumS w 多种植物 的干燥茎的统称 在我国已有 2000 多年的药用历史 早在 神农本草经 本草纲目 等著作中 就有记载 并列居上品 著名的有金钗石斛 D nobile Lindl 铁皮石斛 D officinale Kimura et Migo 霍山石斛 D huoshanense 1 等 目前我国 76 种石斛属植物中 有近 40 种被作为药 用 传统中医常将其用于滋阴清热 生津益胃 止咳润肺 清音明目等 2 现代药理研究表明石斛 具有多种医药功效 可预防和治疗白内障 增强免疫功能 治疗肿瘤 降血糖 抗氧化等 在临床 中应用相当广泛 化学成分分析显示 药用石斛所含的化学成分类型多样 包括生物碱 多糖 菲 类 联苄类 黄酮类 倍半萜类 香豆素 甾体及挥发油等 3 1 11 1 石斛生物碱石斛生物碱 生物碱是石斛药材中最重要的活性成分之一 也是最早分离并进行结构确认的化合物 1932 年 日本人铃木秀干在中药金钗石斛 D nobile 中首次分离获得一种生物碱 命名为石解碱 Dendrobine 4 1935 年 陈克恢等再次在金钗石斛中分离得到石斛碱 并测定金钗石斛中总 生物碱的含量为 0 52 5 1964 年 犬伏康夫等确定石斛碱具有倍半萜骨架结构 6 迄今为止 已 经从 16 种石斛属植物分离得到 32 种生物碱 主要骨架共分为四大类即石斛碱型 八氢中氮茚型 四氢比咯型和咪唑型 7 石斛碱型石斛碱是石斛属植物中存在最多的一类重要生物碱 共有 19 种 其基本骨架是含有 15 个 C 的 picrotoxane 型倍半萜 它含有一个五元内酯环 N 与 picrotoxane 倍半萜的 2 位与 11 位形成五元杂环 N 上通常连有甲基等官能团 按其骨架结构变化 石斛碱型 石斛碱又分为七种骨架类型 7 10 1997 年 台湾学者 Sha 等首次通过 羰基游离基环化反应全合 成了纯手性的石斛碱 dendrobine 8 2000 年 日本学者 Morita 等从金钗石斛中分离得到 一种很少见的五元内酯开环的石斛碱型生物碱 Mubironine C C17H29O3N 其 15 位与 3 位的 内 酯断开 八氢中氮茚 octahydroindolizone 类 7 10 12 石斛碱是一种含有一个氮原子的五元和六 元并环体系的生物碱 该类生物碱共有 6 种 四氢比咯型 7 13 16 生物碱共有 5 种 Leete 等用放射 性标记化合物 1 14C 醋酸钠和 4 2 14C 邻琥珀酰基苯甲酸加入报春石斛的生长过程 发现 1 14C 醋酸钠中的14C 主要存于该类石斛碱的第 5 位 C 上 提出琥珀酰苯甲酸是其合成前体 Breuer 等 16 以邻羧基苯基环丙酮为原料水解得到了一种四氢比咯型生物碱石斛宁 shihunine 咪唑型 17 18 生物碱有一个典型的咪唑环结构 该类生物碱有 2 种 1993 年 Hemscheidt 等 18 根据标记的 3C 和15N 研究其生物合成途径 推测该类生物碱可由 D L 赖氨酸生物合成 前期研究报道 铁皮石斛的生物碱含量只有金钗石斛的 1 20 1 金钗石斛含较多生物碱 其 一年生含量最高 为 0 5489 随年份增加 其含量依次减少 铁皮石斛中几乎不含生物碱 三年 生最高也仅含 0 0121 3 此外 文献报道野生石斛茎叶中总生物碱的含量仅有 0 3 2 文中发现 人工培植的金钗石斛中总生物碱含量高于野生品种 为 0 5489 因此 预测人工培植品将可替代 野生品 铁皮石斛中总生物碱含量较低 诸燕等 19 研究发现 人工栽培的铁皮石斛与市场购买的 铁皮枫斗药材总生物碱在 0 0190 0 0430 浙江省 11 个铁皮石斛种质一年生 二年生 三年生 样品平均总生物碱为 0 0253 0 0270 0 0326 云南产一年生铁皮石斛平均总生物碱为 0 0343 1 21 2 石斛多糖石斛多糖 石斛多糖是石斛类中药材的主要有效成分 为大分子化合物 是铁皮石斛的主要药效成分 目 前对中药多糖的分析以含量和单糖组成分析为主 特别是后者 在分析仪器的普及 色谱及色谱联 用技术的发展等因素的推动下 已经成为 2010 年版药典铁皮石斛质量标准的检测方法之一 多糖类成分的化学结构复杂 一级结构主要反映糖链的糖基组成 各种组成单糖的分子数比例 单糖残基的构型 残基之间的连接次序等内容 单糖残基的排列顺序对多糖的活性有影响 二级结 构反映多糖骨架链的构象 三级结构反映了单糖残基中各官能团之间非共价作用形成的有序 规则 而粗大的空间构象 四级结构指多聚链间非共价键结合形成的聚集体 多糖的高级结构与其生物学 功能密切相关 目前铁皮石斛多糖研究以含量测定和一级结构研究为主 在此基础上 2010 年版 精品文档 2欢迎下载 中国药典 制定了专属性更强的铁皮石斛鉴别和含量测定方法 同时 铁皮石斛多糖的指纹图谱 分析 高级结构 构效关系 生物化学等方面的研究还有待继续深入地开展 相信随着色谱 电泳 等现代分离技术的发展 质谱技术在生物大分子质量与结构分析中 色谱 质谱联用技术在化学成 分定性 定量分析中的广泛应用 铁皮石斛多糖的活性成分及结构功能通过相关药效学的研究将能 够得到明确的界定 在此基础上 铁皮石斛的质量标准会有质的提高 20 多糖其含量多少是评价药材品质的重要指标之一 王建 21 等人的实验结果显示 广西 6 个产 地的马鞭石斛中多糖的含量差异较大 其中以田阳县的马鞭石斛的多糖含量最高 达 11 85 其 他产地的马鞭石斛多糖含量分别为 10 93 10 08 4 18 4 39 5 20 因石斛为多年生植物 有效成分的积累与其生长年限 生长环境等都存在着密切的联系 不同产地的马鞭石斛之间多糖含 量差别较大 可能与以上因素有一定的关系 诸燕等 19 研究浙江人工栽培的铁皮石斛 发现二年生铁皮石斛多糖平均质量分数达 34 47 不同种质 生理年龄的铁皮石斛多糖质量分数存在显著差异 李彩霞 20 比较不同采收期铁皮石斛 多糖含量 春季 3 月 夏季 6 月 秋季 9 月 和冬季 12 月 的铁皮石斛多糖含量分别为 4 59 5 37 5 92 和 6 24 以冬季采收为佳 尚喜雨 23 对铁皮石斛的组培苗 野生植株 栽 培植株中多糖的含量及分布进行系统分析和研究 发现铁皮石斛的多糖含量很高 尤以茎段为最多 不同部位的含量存在一定差异 茎部的差异大于根和叶 人工栽培的两年生植株的多糖含量比一年 生的多 野生型的比栽培型的多 杀青后烘干处理可以有效地减少多糖在处理过程中的损失 在前人研究基础上 近 10 年从铁皮石斛中分离得到更多的多糖 杨虹等 24 分离得到两个多糖 即 DT2 和 DT3 分子量分别为 7 4 10 5 和 5 4 10 5 DT2 和 DT3 的结构主要以 1 4 D Glc 缩合而成 末端糖为 1Gal 1Glc 及 1Ara 葡萄糖和半乳糖上含有少量的分支 并含少量的木 糖 阿拉伯糖和甘露糖 Hua 等 25 分离得到一个结构为 O 乙酰葡萄甘露聚糖类型的多糖 主链由 1 4 甘露型吡喃糖基和 吡喃葡萄糖基重复构成 支链由 1 3 甘露糖基 1 3 葡萄糖基和少量的阿拉伯呋喃糖基组成 支链连接在主链末端糖基的 6 位上 1 4 甘露糖基 和葡萄糖基的 2 位被乙酰化 单糖组成为甘露糖 葡萄糖和阿拉伯糖按 40 2 8 4 1 的摩尔比例 组成 何铁光等 26 从铁皮石斛原球茎分离得到均一组分多糖 DCPP3c 1 相对分子质量为 72 4 由 甘露糖 鼠李糖 半乳糖醛酸 葡萄糖 半乳糖和阿拉伯糖组成 其分子物质的量之比为 1 1204 1 1 046 23 354 3 828 1 046 DCPP3c 1 中 1 6 键连接的残基占 14 0 1 2 或 1 4 键连接的残基占 40 7 1 3 键连接的残基占 45 3 铁皮石斛多糖的结构特点见表 1 1 27 表 1 1 从铁皮石斛中分离得到的多糖 序号多糖名称分子量单糖组成参考文献 黑节草多糖 100000 0 甘露糖型吡喃糖 露糖型吡喃糖 喃糖 葡萄糖 其他戊糖 28 黑节草多糖 500000 0 甘露糖型吡喃糖 露糖型吡喃糖 喃糖 葡萄糖 其他戊糖 28 黑节草多糖 120000 2 甘露糖型吡喃糖 露糖型吡喃糖 喃糖 葡萄糖 其他戊糖 28 2 O 乙酰葡萄糖 甘露聚糖 甘露糖 葡萄糖 阿拉伯糖 40 4 8 4 1 29 DT2740000 葡萄糖 半乳糖 阿拉伯糖 甘露糖 5 9 1 0 0 8 0 5 30 DT3540000 葡萄糖 半乳糖 阿拉伯糖 甘露糖 7 9 1 3 1 0 0 5 0 7 30 DCPP1a 1189000 甘露糖 葡萄糖 7 015 1 31 精品文档 3欢迎下载 多糖含量测定的方法有很多 一类是利用多糖的还原性 如 3 5 二硝基水杨酸盐比色法和 Somogyi Nelson 法 另一类是普遍使用的利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物 再 与酚类或胺类化合物缩合 生成有特殊颜色的物质这一性质进行测定 如苯酚 硫酸法和蒽酮硫酸 法 32 苯酚 硫酸法是常用测定多糖含量的方法 可用于甲基化糖 戊糖和多聚糖的测定 方法简 单 灵敏度高 试验时基本不受蛋白质存在的影响 蒽酮 硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物 所以用该法测出的多糖含量 实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量 1 31 3 铁皮石斛的其他化学成分铁皮石斛的其他化学成分 利用先进的检测技术对中药材或其来源植物的化学成分进行定性和定量分析 并结合多元统计 分析的方法实现对中药的基源鉴定 20 陈晓梅等利用此方法对铁皮石斛茎中分离鉴定 其中所含 化合物如表 1 2 所示 表 1 2 铁皮石斛茎中分离鉴定的化合物 化合物类别化合物成分参考文献 铁皮石斛素 A dendrocandin A 33 铁皮石斛素 B dendrocandin B 33 铁皮石斛素 C dendrocandin C 34 铁皮石斛素 D dendrocandin D 34 铁皮石斛素 E dendrocandin E 34 铁皮石斛素 F dendrocandin F 35 铁皮石斛素 G dendrocandin G 35 铁皮石斛素 H dendrocandin H 35 铁皮石斛素 I dendrocandin I 35 4 4 二羟基 3 5 二甲氧基联苄 4 4 dihydroxy 3 5 dimethoxybibenzyl 33 3 4 二羟基 5 4 二甲氧基联苄 3 4 dihydroxy 5 4 dimethoxybibenzyl 33 3 羟基 3 4 5 三甲氧基联苄 3 O methylgigantol 33 4 4 二羟基 3 3 5 三甲氧基 联苄 dendrophenol 33 3 4 二羟基 5 甲氧基联苄 3 4 dihydroxy 5 methoxybibenzyl 36 3 4 二羟基 3 5 二甲氧基联 苄 gigantol 33 dihydroresveratrol 36 dendromoniliside E 36 二氢白藜芦醇 denbinobin 36 2 4 7 三羟基 9 10 二氢菲 2 4 7 trihydroxy 9 10 dihydrophenanthrene 36 4 5 二羟基 3 3 二甲氧基联苄 4 5 dihydroxy 3 3 dimethoxybibenzyl 37 2 3 4 7 四甲氧基菲 2 3 4 7 tetramethoxyphenanthrene 38 1 5 二羧基 1 2 3 4 四甲氧基 菲 nakaharain 38 2 5 二羟基 3 4 二甲氧基菲 2 5 dihydroxy 3 4 dimethoxyphenanthrene 38 2 7 二羧基 3 4 8 三甲氧基菲 Confusarin 38 2 5 二羧基 3 4 二甲氧基菲 nudol 38 芪类 3 5 二羧基 2 4 二甲氧基菲 bulbophyllanthrin 38 酚类N p 香豆酰酪胺 paprazine 39 精品文档 4欢迎下载 反 N 4 羟基苯乙基 阿魏酸酰 胺 moupinamide 39 二氢松柏醇二氢对羟基桂皮酸酯 dhydroconiferyl dihydro p cumarate 39 二氢阿魏酰酪胺 dihydro feruloyltyramine 39 对羟基苯丙酰酪胺 p hydroxyphenylpropionyl tyramine 39 丁香酸 syringic acid 39 丁香醛 syringaldehyde 39 香草酸 vanillic acid 39 对羟基苯丙酸 p hydroxy phenylpropionic acid 37 39 对羟基桂皮酸 p hydroxy cinnamic acid 37 39 阿魏酸 ferulic acid 39 对羟基苯甲酸 4 hydroxybenzoic acid 39 松柏醇 3 4 hydroxy 3 methoxyphenyl 2 propen 1 ol 37 香草醇 4 hydroxy 3 methoxybenzyl alcohol 37 穆坪马兜铃酰胺 N trans feruloyl tyramine 37 顺式阿魏酰对羟基苯乙胺 37 反式桂皮酰对羟基苯乙胺 37 丁香脂素 O D 吡喃葡萄 糖苷 syringaresinol D glucopyranoside 40 Icariol A2 4 O D glucopyranoside 40 lyoniresinol 3a O D glucopyranoside 40 裂异落叶松脂醇 secoisolariciresinol 40 左旋丁香脂素 syringaresinol 37 40 丁香脂素 4 4 O 双 D 葡萄糖 苷 syringaresinol 4 4 O bis D glucoside 40 木质素类 二氢丁香苷 Dihydrosyringin 39 koaburaside 39 3 4 5 三甲氧基苯基 1 O D 芹糖 1 2 D 葡萄糖苷 khaephuouside 40 4 羟基 2 6 二甲氧基苯基葡萄 糖苷 leonuriside A 40 2 甲氧基苯基 1 O D 芹糖 1 2 D 葡萄糖苷 2 methoxyphenyl 1 O D apiofuromosyl 1 1 ap D glucopyranoside 40 4 烯丙基 2 6 二甲氧基苯基葡 萄糖苷 37 酚苷类 金盏花苷 Erigeside dictamnoside A 39 腺苷 adenosine 36 尿苷 uridine 36 核苷类 鸟苷 guanosine 36 钩状石斛素 aduncin 36 内酯类 洋地黄内酯 金盏菊花素 digiprolactone calendin 36 黄酮类柚皮素 4 5 7 三羟基二氢黄酮 naringenin 37 39 精品文档 5欢迎下载 3 5 5 7 四羟基二氢黄酮 3 5 5 7 tetrahydroxyflavanone 39 胡萝卜苷 daucosterol 36 甾类 谷甾醇 sitosterol 36 反式阿魏酸二十八烷基酯 n octacostyl ferulate 36 对羟基反式肉桂酸三十烷基酯 defuscin 36 脂肪酸酯 对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯 n triacontyl cis p coumarate 36 十六烷酸 hexadecanoic acid 36 脂肪酸 十七烷酸 heptadecanoic acid 36 脂肪醇三十一烷醇 hentriacontane 36 苯丙素苷 1R 1 4 羟基 3 5 二甲氧 基苯基 1 丙醇 4 O D 葡萄 糖苷 1R 1 4 hydroxy 3 5 dimethoxylphenyl propan 1 ol 4 O D glucopyranoside 40 糖类蔗糖 sucrose 36 其他5 羟甲基糠醛 5 hydroxymethyl furaldehyde 36 在植物化学研究方面 李燕等 33 35 37 41 从铁皮石斛茎中分离鉴定了 27 个联苄类化合物 杨莉 等 42 报道 用 HPLC 分析了 31 种石斛属植物 不包括铁皮石斛 中的 11 个酚性成分 包括联苄化 合物 5 个 菲和芴酮化合物各 3 个 发现联苄化合物在石斛属植物中普遍存在 其中 3 4 二羟 基 3 5 二甲氧基联苄 gigantol 和 4 4 二羟基 3 3 5 三甲氧基联苄 moscatilin 在检测 植物中的分布最广 陈晓梅等 43 分析了包括铁皮石斛在内的 24 种石斛属植物 62 份样品的化学成 分 得到了类似的结果 并发现野生铁皮石斛的联苄含量高于人工栽培的 说明人工栽培铁皮石斛 中小分子化学成分的积累与野生铁皮石斛的存在差别 联苄成分在铁皮石斛样品中的含量均较低 3 4 二羟基 4 5 二甲氧基联苄的平均含量最高 仅为 0 05 且目前还没有关于该化合物药理 活性研究的报道 研究联苄成分与铁皮石斛功效的关系 将有助于明确铁皮石斛的药效成分 提高 药材的质量控制标准 根据陈晓梅等 43 的报道 采集自云南省 浙江省和贵州省的 12 个铁皮石斛样品中均能检测到 柚皮素 4 5 7 三羟基黄烷酮 naringenin 和 3 4 二羟基 4 5 二甲氧基联苄 此外 这两个 成分在石斛属植物中也有较广泛的分布 柚皮素在 20 种植物的 56 份样品中存在 3 4 二羟基 4 5 二甲氧基联苄在 13 种植物的 40 份样品中存在 以植物样品中柚皮素 3 4 二羟基 4 5 二 甲氧基联苄 gigantol 和 moscatilin 等 4 个化合物含量 多糖含量 以及多糖的单糖组成中甘露 糖和葡萄糖相对含量比 M G 为预测变量 利用多元统计分析的判别分析 discriminant analysis 建立判别函数 能将铁皮石斛与 4 种近似植物 晶帽石斛 齿瓣石斛 兜唇石斛和束花 石斛完全区别开来 这一结果同时说明柚皮素 联苄和多糖等化学成分对石斛属植物的鉴别有重要 意义 引入多种类型化学成分的指标进行判别分析 有助于提高研究对象分类的准确性 1 3 11 3 1 氨基酸类氨基酸类 铁皮石斛含有天门冬氨酸 谷氨酸 甘氨酸 缬氨酸 亮氨酸 苏氨酸 丝氨酸 丙氨酸 胱 氨酸 蛋氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 组氨酸 精氨酸 脯氨酸 酪氨酸等 16 种氨基酸 前 5 种占 总氨基酸的 53 含有除色氨酸以外的所有人体必须的氨基酸 44 人工培养铁皮石斛圆球体及分 化苗中含有除上述 16 种氨基酸外 还含苯丙氨酸 其中 7 种是人体必需但又不能自身合成的氨基 酸 45 1 3 21 3 2 微量元素微量元素 诸燕等 19 测定铁皮石斛中 11 种金属元素含量 发现铁皮石斛中钾 钙 镁 锰 锌 铬和铜 平均质量分数分别为 1205 23 766 82 158 25 31 06 4 28 8 28 0 97mg kg 砷 汞 铅和 镉 4 种重金属元素含量 除 1 个样品镉元素超过限量指标 0 07mg kg 外 均在规定限度范围内 并 且种质与生理年龄对金属元素的积累存在显著影响 46 精品文档 6欢迎下载 在人工铁皮石斛 原球茎组织培养物 铁皮枫斗与铁皮石斛胶囊中 10 种主要微量元素 Cu Zn Fe Mn Ca Mg K Cr Sr B 含量非常相近 47 且原球茎组织培养物的 9 种微量元素 除 Cu 外 含量均最高 由此提示 以滋补作用为研究方向 铁皮石斛具有巨大的开发价值 1 3 31 3 3 木脂素类木脂素类 已报道 44 48 丁香脂素 O D 吡喃葡萄糖苷 icariol A2 4 O D glucopy ranoside lyoniresinol 3a O D glucopyranoside 裂异落叶松脂醇 丁香脂素 4 4 O 双 D 葡萄糖苷和丁香脂素等木脂素类化合物 1 3 41 3 4 酚酸类酚酸类 已报道 41 48 51 koaburaside 丁香酸 丁香醛 香草酸 对羟基苯甲酸 松柏醇 香草醇 4 烯丙基 2 6 二甲氧基苯基葡萄糖苷 2 甲氧基苯基 1 O D 芹糖 1 2 D 葡萄糖苷 3 4 5 三甲氧基苯基 1 O D 芹糖 1 2 D 葡萄糖苷和 1 R 1 4 羟基 3 5 二甲氧基苯基 1 丙 醇 4 O D 葡萄糖苷等酚酸类化合物 1 3 51 3 5 苯丙素类苯丙素类 已发现 41 48 E 对羟基苯丙酸 对羟基桂皮酸 反式桂皮酸酰对羟基苯乙胺 顺式阿魏酸酰 对羟基苯乙胺 阿魏酸 dictamnoside A 反式阿魏酸二十八烷基酯 对羟基反式肉桂酸三十烷基 酯 对羟基顺式肉桂酸三十烷基酯 4 烯丙基 2 6 二甲氧基苯基葡萄糖苷和二氢松柏醇二氢对羟 基桂皮酸酯等苯丙素类化合物 1 3 61 3 6 芪类其衍生物芪类其衍生物 从石斛中分离出来的芪类化合物主要包括联苄 二氮杂菲等 其药理活性主要为抗肿瘤 目前 从铁皮石斛中分离鉴定的芪类化合物有 双苄酚类及菲酚类化合物毛兰素 erianin 和鼓槌菲 chysotoxene 菲醌母核金钗石斛菲醌 denbinobin 52 联苄类化合物 dendrocandinA dendrocandin B dendrocandin C dendrocandinD 和 dendrocandin E 53 4 4 dihydroxy 3 5 dimethoxybibenzyl 3 4 dihydroxy 5 4 dimethoxybibenzyl 3 O methylgigantol dendrophenol 和石斛酚 gigantol 54 上述化合物结构特点见表 1 3 图 1 1 表 1 3 铁皮石斛中芪类化合物结构 类型化合物名称结构参考文献 菲酚类 chysotoxene 55 联苄类 Erianin 55 菲醌类 denbinobin 52 联苄类 dendrocandin A R1 R2 OH R3 R5 R6 OCH3 R4 H 53 联苄类 dendrocandin B 53 联苄类 dendrocandin C R1 R2 R5 OH R3 R6 OCH3 R4 H 54 联苄类 dendrocandin D R1 R2 R5 OH R3 OCH3 R6 OCH3 R4 H 54 联苄类 dendrocandin E R1 R2 R4 R5 OH R3 OCH3 R6 H 54 联苄类 4 4 dihydroxy 3 5 dimethoxybibenzyl R2 R5 OH R1 R3 OCH3 R4 R6 H 53 联苄类 3 4 dihydroxy 5 4 dimethoxybibenzyl R1 R2 OH R3 R5 OCH3 R4 R6 H 53 联苄类 3 O methylgigantol IV R1 OH R3 R4 R5 OCH3 R2 R6 H 53 联苄类 dendrophenol IV R2 R4 R5 OH R1 R3 OCH3 R6 H 53 联苄类 gigantol IV R1 R5 OH R3 R4 OCH3 R2 R6 H 53 精品文档 7欢迎下载 图 1 1 铁皮石斛中芪类化合物母核 1 3 71 3 7 菲类和联苄类化合物菲类和联苄类化合物 李榕生等 56 从铁皮石斛乙醇提取物中得到 6 个化合物 2 3 4 7 四甲氧基菲 1 5 二羧基 1 2 3 4 四甲氧基菲 2 5 二羟基 3 4 二甲氧基菲 2 7 二羧基 3 4 8 三甲氧基菲 2 5 二羧基 3 4 二甲氧基菲 3 5 二羧基 2 4 二甲氧基菲 李燕等 41 分离得到 denbinobin 2 4 7 三羟基 9 10 二氢菲 管惠娟和 Li 等 48 53 57 58 发现 4 5 二羟基 3 3 二甲氧基联苄 铁皮石斛素 A C D E F G J K H L B M N O I P Q R 4 4 二羟基 3 5 二甲氧基联苄 3 4 二羟基 5 4 二甲氧基联苄 3 羟基 3 4 5 三甲氧基联苄 4 4 二羟基 3 3 5 三甲氧基 联苄 3 4 二羟基 5 甲氧基联苄 3 4 二羟基 3 5 二甲氧基联苄 二氢白黎芦醇和 dendromoniliside E 等 27 个联苄类化合物 1 41 4 石斛的药理作用石斛的药理作用 1 4 11 4 1 增强机体免疫作用增强机体免疫作用 铁皮石斛颗粒 TPSH 可促进荷瘤动物巨噬细胞的吞噬功能 增强 T 淋巴细胞的增殖和分化及 NK 细胞的活性 并能明显提高荷瘤动物的血清溶血素值 提示 TPSH 无论是对非特异性免疫功能 或是特异性细胞免疫以及体液免疫功能 均有一定的提高作用 49 铁皮石斛多糖对 S180 实体瘤均 有一定的抑制作用 其抑瘤率为 9 7 26 8 并且铁皮石斛多糖对 S180 肉瘤小鼠 T 淋巴细胞转 化功能 NK 活性 巨噬细胞吞噬功能及溶血素值均有明显提高作用 59 杨明晶等 60 选择低 中 高剂量的铁皮枫斗西洋参胶囊 58 117 350mg kg 调节小鼠的免疫功能 发现每天补充中 高 剂量的铁皮枫斗西洋参 30d 后小鼠的细胞免疫功能 体液免疫功能 单核 巨噬细胞吞噬功能和 NK 细胞活性明显增强 1 4 21 4 2 抗氧化作用抗氧化作用 何铁光等 26 研究证明 铁皮石斛原球茎多糖组分 DCPP1a 1 能有效地清除超氧阴离子和 OH 并 能抑制小鼠肝匀浆及肝线粒体丙二醛 MDA 的生成和肝线粒体肿胀 鲍素华等 61 研究发现不同相 对分子质量的多糖 在不同抗氧化体系中 其抗氧化活性差异显著 DSP 对 OH 清除作用强于其他 多糖 DSP1 对 DPPH 的清除率 抑制 Fe2 VC 诱导小鼠肝匀浆脂质过氧化能力 抑制 H2O2诱导红细 胞氧化溶血能力和总抗氧化能力最佳 DSP2 抗氧化能力最弱 铁皮石斛多糖分子质量小于 3 53 104u 或大于 7 44 104u 时抑制 DNA 损伤的生物活性较高 且明显强于 VC 汤小华等 62 研究发 现鲜铁皮石斛 3g kg 和铁皮枫斗 0 5 0 90 1 35g kg 均能提高血清和肝中超氧化物歧化酶 SOD 肝谷胱甘肽过氧化物酶 GSH Px 活性 鲜铁皮石斛 6g kg 能提高血清 SOD 肝 GSH Px 鲜铁皮石斛 3 6g kg 和铁皮枫斗 0 45 0 90g kg 均能降低血清和肝 MDA 鲜铁皮石斛 精品文档 8欢迎下载 9g kg 能降低血清 MDA 铁皮石斛和铁皮枫斗对急性酒精性肝损伤模型小鼠具有抗氧化作用 铁皮石斛水提物 大豆异黄酮提取物及二者合用对正常小鼠红细胞 SOD 活力的影响均无显著差异 P 0 05 但可显著提高小鼠肝组织中 SOD 活性和降低 MDA 含量 联合用药对小鼠肝脏 SOD 活性 增效系数 Q 值为 1 44 说明铁皮石斛水提物与大豆异黄酮提取物具有协同抗氧化作用 63 1 4 31 4 3 抗肿瘤作用抗肿瘤作用 马国祥等 64 分析石斛中的 18 个种 发现铁皮石斛含有鼓槌菲 chrysotoxene 和毛兰素 erianin 这两个菲类化合物具有对肝癌和艾氏腹水癌细胞抑制活性 李燕 41 进行抗肿瘤活性 的初步筛选 发现联苄类化合物 4 4 二羟基 3 5 二甲氧基联苄对人卵巢癌细胞株 A2780 有活 性 4 4 二羟基 3 3 5 三甲氧基联苄对人胃癌细胞株 BGC 823 和人卵巢癌细胞株 A2780 有活性 铁皮枫斗多糖 菲类 联苄类化合物具有抗肿瘤活性及抗多药耐药性 能抑制多种人体肿瘤细 胞株增殖 铁皮石斛多糖联合 rIL 2 显著增强脐带血和肿瘤病人外周血 LAK 细胞体外杀伤作用 通过 LAK rIL 2 免疫作用治疗恶性肿瘤 毛兰素 erianin 对小鼠肝癌抑瘤率为 50 82 对肿瘤细 胞株 K562 生长的抑制作用 随着药物浓度的增加而增强 临床观察也发现 65 铁皮枫斗晶 铁皮 枫斗颗粒 胶囊 是放化疗肿瘤患者对症辅助治疗的有效药物 能显著减轻放疗副反应 多糖和芪 类化合物的抗肿瘤活性 提示铁皮石斛不仅可以用于癌症对症治疗的辅助用药 亦可作为抗肿瘤药 物研究开发的候选物 1 4 41 4 4 抗疲劳作用抗疲劳作用 石斛洋参冲剂能使异丙肾上腺素处理小鼠游泳时间延长 增加小鼠耐缺氧能力 提高甲亢型小 鼠存活率 铁皮枫斗晶能维持运动小鼠肝糖原含量 明显降低运动后血清尿素氮和血乳酸含量 均 表现明显的抗疲劳作用 66 1 4 51 4 5 降血糖作用降血糖作用 吴昊姝等 67 对铁皮石斛浸膏的降血糖作用及其机制研究表明 铁皮石斛浸膏对正常小鼠血糖 及血清胰岛素水平无明显影响 但可使链脲佐菌素性糖尿病大鼠的血糖值降低 血清胰岛素水平升 高 胰高血糖素水平降低 还可通过增加大鼠胰岛素 细胞 减少 细胞 修复链脲霉素诱导的 细胞损伤 进而升高血清胰岛素 降低胰高血糖素水平 铁皮石斛也可通过抑制肝糖原分解和促进 肝糖原合成 减少血糖来源 增加血糖去路 影响肾上腺素性高血糖小鼠血糖和肝糖原水平 陈爱 君等 68 发现铁皮石斛膏 3g 生药 kg 剂量灌胃给药可降低四氧嘧啶所致糖尿病模型小鼠的血糖 值 并明显改善该模型小鼠的糖耐量 减少其血糖曲线下面积 1 4 61 4 6 生津作用生津作用 铁皮石斛的生津作用 主要表现为促进腺体分泌和脏器运动 27 对消化系统作用 最初研究表明 铁皮石斛和西洋参合用不仅能促进正常家兔的唾液分泌 还 能拮抗阿托品对家兔唾液分泌的抑制作用 铁皮石斛单用能促进大鼠胃液分泌 小肠推进运动和小 鼠排粪功能 其机制与抑制细胞膜上的 Na K ATP 泵有关 69 临床应用也证实 铁皮石斛可以显 著改善口腔气管插管患者口腔溃疡愈合率 70 进一步证实了铁皮枫斗晶能养阴益胃生津 维护消 化系统功能 对呼吸系统的作用 与前期铁皮石斛提取物结果相同 铁皮枫斗晶能显著促进小鼠气管酚红排 泌和家鸽气管内墨汁运动速度 抑制氨水引起的小鼠咳嗽 显示明显的祛痰和镇咳作用 71 1 4 71 4 7 其他药理作用其他药理作用 铁皮石斛提取物对易卒中型自发性高血压大鼠 SHR sp 具有缓和持久的降压作用 并且其降 压作用与用量有一定相关性 72 对 SHR sp 大鼠具有延长生存时间 提高生存率 预防中风的作用 并且铁皮石斛提取物与西药尼莫地平合用对 SHR sp 大鼠能较好地延长生存时间 提高生存率 预 防中风 73 鹿伟等 74 对小鼠经口灌胃不同剂量铁皮石斛样品 30d 与阴性对照组相比 铁皮石斛 样品 3 个剂量组小鼠负重游泳时间均显著延长 血乳酸和肌酸激酶含量均显著降低 铁皮石斛在提 高运动耐力的同时 能显著加快代谢产物的清除 同时通过调节机体免疫功能 促进疲劳的尽快恢 精品文档 9欢迎下载 复 黄琴等 75 研究得出铁皮石斛胚状体各剂量组 0 2 0 4 0 8g kg 可以在人体跑步 30min 后 提高血糖含量并降低全血乳酸含量 中 高剂量组可以降低运动后肝糖元及肌糖元的消耗 各剂量 组均能明显降低血尿素氮的含量 铁皮石斛生境独特 对气候要求十分严格 自然成活率极低 野生资源濒临枯竭 76 1987 年 国家将铁皮石斛列为重点保护野生珍稀药材品种 第 1 批 中国珍稀濒危保护植物名录 将铁皮石 斛列入其中 濒危野生动植物种国际贸易公约 也将其列为濒危和特别需要关注的药用植物加以 保护 77 近年来 石斛属植物资源极其紧缺 某些种已濒临灭绝 而铁皮石斛的市场需求持续旺 盛 但其野生资源有限 加之铁皮石斛生境不断遭受破坏 导致铁皮石斛野生资源濒临灭绝 无法 满足市场需求 因此 应设法提高铁皮石斛多糖提取率 基于此 本试验在单因素试验基础上 采 用正交试验探讨铁皮石斛多糖的最佳提取工艺条件 对石斛粉碎程度 液料比 多糖提取温度和提 取时间 4 个因素进行工艺优化 确定最优提取参数 2 实验 2 12 1 材料和试剂 仪器材料和试剂 仪器 2 1 12 1 1 仪器仪器 电子天平 AL204 IC 梅特勒 托利多仪器 上海 有限公司 低速台式离心机 800 型 上 海手术器械厂 循环水式真空泵 SHZ D 巩义市予华仪器有限责任公司 数显恒温水浴锅 JXL 2S 6A 江苏省金坛市金祥龙电子有限公司 中草药粉碎机 FW177 型 天津市泰斯特仪器有 限公司 研钵 研磨棒 旋转蒸发器 RE 2000A 型 上海亚荣生化仪器厂 紫外可见分光光度计 722G 型 上海精密科学仪器有限公司 烧杯 量筒 刻度试管 圆底烧瓶 回流管 2 1 22 1 2 材料及试剂材料及试剂 干燥的铁皮石斛颗粒 D 无水葡萄糖标准品 含量 98 批号为 20150303 上海金穗生物科 技有限公司 蒽酮 硫酸 无水乙醇 水为蒸馏水 2 22 2 试验方法试验方法 采用硫酸 蒽酮比色法测定其多糖含量 在 620nm 处使用紫外 可见分光光度计测定吸收度 2 2 12 2 1 预处理与纯化过程预处理与纯化过程 精密称取铁皮石斛干燥粉末 过孔径为 0 354mm 筛 1 000g 置圆底烧瓶中 用 70mL 乙醇 95 加热回流 2 次除去杂质 每次一小时 设置反应条件液 mL 料 g 比为 65 1 提取时 间为 2h 提取 2 次 在 90 热水下回流提取 提取之后过滤 将滤液置 250mL 容量瓶中定容 得 石斛多糖粗提液 分别精密量取 1mL 定容后的滤液置 10mL 离心管中 加入 9mL 体积分数为 80 的 乙醇 摇匀 冷藏 1h 取出 以 4000r min 离心 15min 所得沉淀加体积分数为 80 的乙醇洗涤 2 次 每次 10mL 弃去上清液 沉淀用热蒸馏水溶解 转移至 25mL 容量瓶中 放冷后加水至刻度 摇匀 即得铁皮石斛多糖浸提液 21 2 2 22 2 2 样品制备及试剂配制样品制备及试剂配制 标准品溶液的制备 精密称取葡萄糖标准品 25mg 置于 250mL 容量瓶中 加水溶解并定容至刻 度 配置成 0 1mg mL 的葡萄糖标准溶液 蒽酮 硫酸溶液的制备 现配现用 精密称取蒽酮 0 1g 加 80 的硫酸溶液 100mL 使溶解 摇匀 放置于棕色瓶中 冷藏 2 2 32 2 3 测定测定 1 测定原理 采用蒽酮 硫酸比色法测定其多糖含量 在 620nm 处使用紫外 可见分光光度计测定吸收度 2 测定方法 标准曲线的绘制 分别精密吸取 0 1mg mL 葡萄糖标准品溶液 5ml 20ml 50ml 80ml 置于 100ml 容量瓶中 各加蒸馏水至刻度 将溶液稀释为 5 20 50 80 g mL 精密量取上述各浓度的 溶液及葡萄糖标准液 2 0mL 于 10mL 具塞试管中 精密加入蒽酮硫酸溶液 6 0mL 置水浴加热 精品文档 10欢迎下载 15min 取出 迅速冰浴冷却 15min 室温放置 5min 左右 以蒸馏水代替标准溶液为空白对照 按 照紫外 可见分光光度法 测定 625nm 处吸光度 以浓度 C g mL 为横坐标 吸光度 A 为 纵坐标 进行回归计算 绘制标准曲线 如图 2 1 所示 得回归方程 y 0 0007x 0 0121 相关系 数 R 0 9945 表明葡萄糖浓度在 5 100 g mL 范围内与吸光度呈良好线性关系 图 2 1 葡萄糖标准曲线 样品测定 精密量取本实验制得的石斛多糖浸提液 2mL 于 10mL 具塞试管中 精密加入蒽酮硫 酸溶液 6 0mL 置水浴加热 15min 取出 迅速冰浴冷却 15min 室温放置 5min 左右 以加水试剂 空白对照 按照紫外 可见分光光度法 测定 625nm 处吸光度 记录吸光度值 查标准曲线得知对 应的葡萄糖含量 2 2 42 2 4 铁皮石斛多糖抗氧化性测定铁皮石斛多糖抗氧化性测定 羟基自由基的清除 Fenton 78 反应 大量研究表明 羟基自由基 OH 具有极强的氧化能力 它能导致生物体内 DNA 蛋白质和脂质氧化损伤 对生物组织产生极强的危害作用 本试验通过 Fenton 法研究铁皮石斛茎多糖对羟基自由基 OH 的清除作用 用 Fenton 反应法产生羟基自由基 OH H2O2 Fe2 体系可通过 Fenton 反应产生经自由基 化 学反应如下 H2O2 Fe2 OH OH Fe3 用 OH 氧化水杨酸产生有色物质 该产物在 510nm 处有强吸收峰 若体系中加入清除 OH 的物质 则会减少有色物质的生成 吸收度降低 吸光度越低 清除 OH 效果越好 测量过程 取 2 支试管并依次编号为 1 2 两支试管各加入 9mmol L 的 FeSO4 1ml 9mmol L 的水杨酸 乙醇溶液 2 00ml 将 1 号试管加入铁皮石斛多糖样品溶液 2 00ml 2 号管加 2 00ml 蒸 馏水作空白对照 最后加入 8 8mmol L 的 H2O2 2 00ml 启动反应 以上试管放入水浴锅 37 恒温水 浴 1h 取出冷却 以蒸馏水作参比 于 510nm 处测定其吸光度 便能测定被测物对 OH 的清除效果 设计实验如表 2 1 表 2 1 多糖清除羟自由基能力 组别吸光度 11 7639 2 对照组 1 8384 3 参比 0 2 2 52 2 5 多糖提取的正交试验多糖提取的正交试验 对本实验分析 影响多糖提取率的因素有很多 有石斛粉碎程度 提取次数 提取时间 液料 比 提取温度等等 经全面考虑 最后确定提取次数 提取时间 液料比为优化因素 分别记作 A B C 和 D 进行四因素正交试验 各因素均取三个水平 因素水平见下表 2 2 所示 表 2 2 因素水平表 精品文档 11欢迎下载 试验因素 水平 A 提取次数B 提取时间C 料 g 液 ml 比 D 石斛粉碎程 度 11150大颗粒 22265小颗粒 33380粉末 本实验不考虑交互作用 故选用 L9 34 正交表 各因素随机安排 将提取次数 A 提取时 间 B 液料比 C 和石斛粉碎程度 D 依次安排 如表 2 3 所示