课题3　血红蛋白的提取和分离

选修一 血红蛋白的提取和分离 学案 1 选修一选修一 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离 学案学案 学习目标 1 尝试对血液中血红蛋白的提取和分离 体验复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方 法 2 了解色谱法 电泳法等分离生物大分子的基本原理 重点和难点 重点 凝胶色谱法的原理和方法 难点 样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 课前预习 1 不同的蛋白质通过凝胶时 相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道 路 程 移动速度 而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道 只能在 移动 路程 移动速度 相对分子质量不同的蛋白 质因此得以分离 2 在一定范围内 缓冲溶液抵制外界的 对溶液 pH 的影响 维持 pH 电泳 是利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 的 不同 使带电分子产生不同的 从而实现样品中各种分子的分离 3 采用 的方法分离红细胞 红细胞洗涤的目的是 以利于后续步 骤的分离纯化 在洗涤好的红细胞中加入 充分搅拌后红细胞破裂 释放 出血红蛋白 血红蛋白溶液经离心后 明显分为 4 层 从上到下的主要成分分别是 对血红蛋白溶液进行透析的目的是去除 4 制作凝胶色谱柱的材料有 装填凝胶色谱柱的材料是 装填时要 缓慢倒人色谱柱 选修一 血红蛋白的提取和分离 学案 2 内 不能有 存在 装填完后 用 20mmol L 的 充分洗涤平衡凝胶 12h 加样时用吸管小心地将 1mL 透析后的样品加到 的顶端 注意不要 破坏 课堂探究 一 基础知识一 基础知识 1 下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理 据图分析 1 图 A 中蛋白质 a 能进入凝胶颗粒内部而蛋白质 b 被排阻在凝胶颗粒外面的原因是 所以蛋白质 在图 B 中的路程就短 移动速度 当 它从凝胶柱中洗脱出来时 蛋白质 还在行进中 2 除了上述原理外 还可以利用哪些原理分离蛋白质 2 人体血浆中的 H2CO3 NaHCO3 NaH2PO4 Na2HPO4等的作用是 体内细胞或物质在体外是否需要与体内一样的环境条件才能保持原有的生物活性 怎样使其保持与体内一样的酸碱度呢 3 电泳时 带正电和负电的蛋白质在电场中的迁移方向是 若蛋白质的带电性质和数量相同 但蛋白质的分子大小不同 则蛋白质在电场中的迁移 情况是 叶绿体色素分离使用的支持物是 电泳分离蛋白质使用的支持物是 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取 决于 凝 胶 颗 粒 蛋白质 a 蛋白质 b A 1 2 3 4 5 B 多孔板 选修一 血红蛋白的提取和分离 学案 3 二 实验操作二 实验操作 1 分析与样品处理有关的问题 1 分离红细胞离心速度不能过高和时间过长的原因是 洗涤红细胞的目的是 用生理盐水洗涤红细胞的原因是 洗涤次数不能过少的原因是 洗涤成功的标志是 2 在红细胞液中加入蒸馏水的目的是 甲苯的作用是 充分搅拌的目的是 3 将血红蛋白从混合液中分离出来所使用的方法是 右图是分离结果示意 图 图中 的物理性质分别是 主要成分分别是 将血红蛋白从中分离出来要经过 过滤和 分离两步 4 右图装置用于 其目的是 若 B 是 血红蛋白溶液 则 A 是 2 以下是凝胶色谱柱的制作过程图解 正确的顺序是 3 右图是装填的凝胶色谱柱 据图分析 1 图中 G 表示 75 表示 加入前需放在洗脱液中膨胀 为了加速膨胀 可用沸水浴加热 这样不但可以节约时间 而且可以 透析袋 A B 打孔 安装 玻璃管挖出凹穴 a b c d e f a SephadexG 75 选修一 血红蛋白的提取和分离 学案 4 2 装填凝胶时要先打开 a 然后一次性倒入并轻轻敲动色谱柱 目的是 装填过程中若发现有气泡存在 必须重装 因为气泡会 降低分离效果 3 装填完后 为了使凝胶装填紧密 还需使用 充分洗涤平衡凝胶 12h 该过程中出现何种现象需要重新装填凝胶色谱柱 4 下图 A 是样品的加入示意图 图 B 是洗脱示意图 1 加样前需先让凝胶面上的缓冲液下降至与凝胶面平齐 操作方法是 加样时正确的操作次序是 2 洗脱液 e 是 洗脱时要打开 待 接近色谱柱底端时 用试管收集流出液 3 如何确定色谱柱的制作是成功的 课堂巩固 1 下列有关血红蛋白提取和分离实验的叙述错误的是 A 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质 此为样品的粗提取 C 通过凝胶色谱法可除去杂质蛋白 即样品的纯化 D 可通过 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 2 凝胶色谱法是一种快速而又简单的分离技术 请据图回答相关问题 1 a b 均为蛋白质分子 其中先从层析柱中洗脱出来的是 原 因是 2 自己制作凝胶色谱柱时 在色谱柱底部 d 位置相当于多孔板的结构可 由 替代 3 凝胶色谱柱的直径大小会影响分离的效果吗 图中 a 和 b 的分离度与凝胶 色谱柱的高度有关吗 4 在哪些情况下需要重装凝胶色谱柱 a c b d a b c d 样品 样品 A B 操作压 e 选修一 血红蛋白的提取和分离 学案 5 5 洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体 填 相同 或 不同 洗 脱时 对洗脱液的流速要求是 6 对样品进行粗分离的方法是 纯化的方法是 判断纯化的蛋白 质是否达到要求 需要进行蛋白质纯化的鉴定 在鉴定的方法中使用最多的是 凝胶电泳 1 较小 较长 较慢 较大 凝胶外部 较短 较快 2 酸或碱 基本不变 带电性质的差异 大小 形状 迁移速度 3 低速短离心 去除杂蛋白 蒸馏水和甲苯 甲苯 脂溶性物质 血红蛋白和沉淀物 分子量较小的杂质 4 玻璃管 橡皮塞 移液管 尼龙纱 尼龙网 凝胶 一次性 气泡 磷酸缓冲液 凝 胶色谱柱的顶端 凝胶面 一 1 1 蛋白质 a 的相对分子质量较小 蛋白质 b 的相对分子质量较大 b 较快 a 2 蛋白质的形状 所带电荷的性质和多少 溶解度 吸附性质和对其他分子的亲 和力 2 缓冲酸和碱对血浆 pH 的影响 维持血浆 pH 基本不变 是 利用配制的缓冲溶液模拟 体内的 pH 环境 3 带正电的蛋白质向阴极迁移 带负电的蛋白质向阳极迁移 向同一极迁移 但分子大 迁移慢 分子小的迁移快 滤纸 凝胶 分子的大小 1 1 离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀 达不到分离效果 去除杂蛋白 以利于后续步骤的分离纯化 生理盐水是等渗溶液 能够维持红细胞正常的形态 洗涤次 数过少 无法除去血浆蛋白 上清液中没有黄色 2 让红细胞吸水胀破 瓦解细胞膜 加速红细胞破裂 3 离心 无色透明液体 白色薄层固体 红色透明液体 暗红色沉淀 物 甲苯 脂溶性物质 血红蛋白 红细胞破碎物 滤纸 分液漏斗 4 血红蛋白的粗 分离 除去样品中分子量较小的杂质 20mol L 的磷酸缓冲液 2 aebdcf 3 1 凝胶的交联程度 膨胀程度及分离范围 凝胶得水值 除去凝胶中可能带有的微 生物 排除胶粒内的空气 2 螺旋夹 使凝胶装填均匀 搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序 3 20mmol L 的磷酸缓冲液 洗脱液流干 露出凝胶颗粒 5 1 打开色谱柱下端的流出口 bcad 2 20mmol L 的磷酸缓冲液 色谱柱下端的 流出口 红色的蛋白质 1 红色区带均匀一致地移动 1 B 解析 血红蛋白提取和分离的程序可以分为四大步 即样品处理 粗分离 纯化和纯度 鉴定 首先通过洗涤红细胞 血红蛋白的释放 离心等操作收集到血红蛋白溶液 此为样 品的处理 A 项正确 再经过透析去除分子量较小的杂质 此为样品的粗分离 B 项错误 通过凝胶色谱法将相对分子质量大于或小于血红蛋白的杂质蛋白除去 此为样品的纯化 C 项正