免疫组化

免疫细胞化学技术 immunocytochemistry,张华屏,免疫细胞化学（immunocytochemistry）或称免疫组织化学（immunohistochemistry）技术，是根据免疫学原理，用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行定位研究的方法，可在组织原位显示抗原（或抗体），如各种蛋白质、多肽、磷脂和糖蛋白等成分。,抗原与抗体的反应具有更高的特异性，但其结合是不可见的，必须借助可见的细胞化学手段显示其反应部位。 Coons（1941）首次用荧光素标记肺炎双球菌黏多糖抗体，检测小鼠肺组织内的肺炎双球菌获得成功，开创了细胞化学中的“免疫细胞化学技术”的新篇章。,20世纪60年代至今，免疫细胞化学技术发展迅猛，相继建立了以酶、铁蛋白、胶体金、荧光素和放射性核素等标记抗原（或抗体）的方法，用以显示抗原抗体反应的分布部位。60年代，Nakane建立了酶标记抗体技术，Sternberger在此基础上改良并建立了辣根过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）技术，Hsu于80年代建立了抗生物素-生物素（ABC）法。,主要内容,免疫细胞化学技术的分类代表性的免疫细胞化学技术PAP法和ABC法免疫细胞化学技术相关的实验操作,根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免疫铁蛋白技术，免疫金-银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术等。,免疫细胞化学术示意图,常用的荧光素是异硫氰酸荧光素（FITC）和四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC），在荧光显微镜下可观察荧光抗体抗原复合物.常用的酶是辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP），它的底物是3，3二氨基联苯胺（DAB）和H2O2,HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。,人呼吸道上皮细胞粘蛋白免疫荧光像,大鼠腺垂体免疫组织化学（PAS法）示生长激素细胞 400,抗体用荧光素、酶、铁蛋白或胶体金以及亲合素等标记的方式有两种，直接法和间接法。,直接法，即用标记抗体与样品中的抗原直接结合。这种方法操作简便，但敏感度不及间接法。间接法是将分离的抗体（第一抗体简称一抗）再作为抗原免疫另一种动物，制备该抗体（抗原）的抗体（第二抗体简称二抗），再以标记物标记二抗。,间接法先后以一抗和标记二抗处理样品，最终形成抗原，一抗和标记二抗复合物。间接法中的一个抗原分子可通过一抗与多个标记二抗相结合，因此它的敏感度较高，而且目前国内外均有多种标记二抗商品供应，使用方便。,免疫细胞化学染色的基本方法,免疫细胞化学染色方法示意图 左图：直接法（一步法） 右图：间接法（二步法）,PAP法 peroxidase-antiperoxidase complex method过氧化物酶-抗过氧化物酶法复合物法,PAP法除需一抗和二抗外，还需制备HRP标记的抗酶抗体，即以HRP作为抗原免疫动物，制成抗HRP抗体，再以HRP标记该抗体制成由3个酶分子与2个抗酶抗体组成的相当稳定的环形PAP复合物。标本先后以一抗、二抗和PAP复合物处理后，再以DAB显色，即可检测抗原的分布。注意：第一抗体和抗酶抗体来自同一种属动物的IgG。,PAP法的主要特征为：1，抗体活性高。PAP法属于非标记抗体酶法，在所有的反应过程中，任何抗体均未与酶连接，避免了标记过程（共价键连接）中对抗体活性的损害，最大限度地保存了抗体活性。,2，灵敏度高。灵敏度是指免疫细胞化学方法所能显示的最少数量 的抗原。从理论上讲，PAP法应该较间接法敏感二倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而PAP复合物含有三个HRP分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/PAP复合物结合，则被连接在抗原部位的酶分子大大增加，所以PAP法具有较高的敏感性。,ABC法avidin-biotin-peroxidase complex method亲合素生物素过氧化物酶复合物法,生物素（biotin）又称维生素H，是从卵黄和肝中提取的一种小分子物质（分子量244.31）；亲合素（avidin）又称卵白素，是从卵白中提取的一种糖蛋白（分子量68kD）。每个亲合素分子有生物素结合的4个位点，二者可牢固结合成不可逆的复合物，亲合素又名抗生物素。,ABC法按一定比例将亲合素与酶标生物素结合在一起，形成亲合素生物素过氧化物酶复合物（ABC复合物），标本中的抗原先后与一抗、生物素化二抗、ABC复合物结合，最终形成晶格样结构的复合体，其中网络了大量酶分子，从而大大提高了检测抗原的灵敏度。,ABC法示意图,在ABC反应中，抗生物素作为桥连接于生物素标记的酶和生物素标记的抗体之间，而生物素标记的过氧化物酶分子又可作为链连接于抗生物素分子之间，于是形成了一个含有3个以上过氧化物酶分子（大于PAP复合物）的网格状复合物，敏感性和特异性大大提高。,ABC法的敏感性强，特异性高，Hsu等将ABC法与PAP法相比较，发现其敏感性较PAP法高2040倍，可显示出PAP法所不能显示的微量抗原。这是因为生物素与抗生物素间有很强的结合力，一个抗生物素分子既可与多个生物素标记的过氧化物酶相结合，又可以结合多个生物素分子，从而增加了生物素标记的抗体或过氧化酶结合抗生物素的能力。,应用ABC法应注意消除内源性生物素的活性。生物素是一种辅酶，它是在脱羟基酶和羟基转换酶等参与催化的代谢环节中产生的羟基的中间载体，存在于某些组织和细胞内。在应用ABC法时，组织内的生物素会与抗生物素结合而产生非特异性染色。,因此，含生物素较高的肝、肾、白细胞、脂肪和乳腺等组织，在应用ABC方法前，应先以0.04的抗生物素和0.01的生物素溶液分别作用20分钟左右，以消除内源性生物素结合活性。神经组织中的乳糖也可与抗生物素结合产生假阳性反应，可用2-甲基-0-甘露糖孵育切片，封闭组织内乳糖分子上的结合点，阻止它与抗生物素的结合。必要时，还需用0.3H202-100甲醇孵育消除内源性过氧化物酶活性。,实验操作,不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗休的制备，组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。,一、抗体使用液的配制这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用的各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。,（1）抗体最佳稀释度的测定方法用已知阳性抗原切片，进行免疫染色，将其阳性强度与背景染色强度以“+”表示，可分为+、+、+、+、（-）。+为最强阳性，+为强阳性，+为较强阳性，+为弱阳性，（-）为阴性。,直接测定法：用于测定第一抗体的最佳稀释度，其它条件稳定可靠。将一抗稀释为1：50，1：100，1：200，1：400，1：500等5个稀释度滴加在阳性抗原切片上，同时设一替代和阴性对照，结果如下：,从表中结果可见，第一抗体稀释到1：400时阳性结果呈强阳性，背景染色减少，其最佳稀释度在1：400-500之间。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀释后染色，找出最佳稀释度。,棋盘（方阵）测定方法：当测定两种以上抗体的最佳配合稀释度时，必须采用此法（见表1-2）。,括号内为背景染色结果，从表中可见第一抗体1：1000，第二抗体1：2000接近最佳稀释度，,（2）抗体稀释液的配制：常用0.01mol/L pH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织上的非特异性吸附：取0.05mol/L pH7.4 TBS100ml，加温到60，再加入优质明胶100mg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入1 g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后，过滤，分装，4保存。,二、组织材料的处理组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏。,三、免疫染色在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：1增强特异性染色的方法（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶（pronase）等；也可用3mol/L尿素处理切片，达到酶消化的目的。,（2）合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。因此，必须使用一系列稀释作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。,（3）温育时间和温度：大部分抗体温育时间为30-60min，必要时可4过夜（约 18h）。温育的温度常用37，也可在室温中进行，对抗原抗体反应强的以室温为佳。37可增强抗原抗体反应，适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。,（4）多层染色法：对弱的抗原可用间接法、PAP和ABC法等，可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。 （5）显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。,2减少或消除非特异性染色的方法组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。,减少或消除非特异性染色最有效方法是在用第一抗体前，加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团，而除去与第一抗体非特异性结合。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有 明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。,使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%-1%NaCl成为高盐溶液,充分洗涤切片,能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。,3显色反应的控制成色质浓度和温育时间可调节 ，增加成色质的量和/或增加底物温育时间，可增加反应产物强度。过氧化物酶显色时，H2O2较大浓度将使显色反应过快而致背景加深；过量H2O2可能抑制酶的活性。4复染根据所用的染色方法和呈现的颜色等，可选用适当的复染方法。如阳性结果呈红或棕色，则用苏木素将细胞核染成兰色，以便定位检测。也可用1%2%甲基绿复染。,四、对照其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：阳性对照；阴性对照；阻断试验；替代对照；空白对照；自身对照；吸收试验。,（一）阳性对照用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。（二）阴性对照用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。,五、免疫细胞化学结果的判断对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。,特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于： 特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。,非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。,免疫细胞化学染色失败的几种原因（1）所染的全部切片均为阴性结果：包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：染色未严格按操作步骤进行；漏加一种抗体，或抗体失效