蛋白质酶工程

蛋白质工程蛋白质工程 2 结构基础 少量 选择题 填空题 蛋白质空间结构的基本组件蛋白质空间结构的基本组件 螺旋 层 环肽链 疏水内核 蛋白质结构的共同特征蛋白质结构的共同特征 疏水内核 疏水相互作用是指非极性基团在任何极 性环境中强烈趋于彼此聚集的择优效应 稳定稳定 螺旋的因素螺旋的因素 螺旋具有极性 所有氢键都沿螺旋轴指向同一方向 螺旋的中心没有空腔 氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性 除甘氨酸外 都具有旋光性 氨基酸的光吸收氨基酸的光吸收 酪氨酸 Tyr 278nm 色氨酸 Trp 279 和苯丙氨酸 Phe 259 能 够吸收紫外光 共轭双键 蛋白质一级结构蛋白质一级结构 多肽链中的氨基酸的排列顺序 包括二硫键的位置数量和链内共价 连接的方式 稳定因素 肽 键 二硫键 都属于共价键 蛋白质二级结构蛋白质二级结构 主要有 螺旋 平行 层 反平行 层 转折 310 螺旋 稳定因素 主要由其内部形成的主链氢键所稳定 氢键的排布方式为二级结构重要特 征 蛋白质三级结构蛋白质三级结构 在二级和超二级结构及结构域的基础上进一步卷曲形成复杂球状 分子结构 蛋白质四级结构蛋白质四级结构 蛋白质分子的亚基结构 1 2 1 2 无亚基并只有单结构域的蛋白质无亚基并只有单结构域的蛋白质 三级结构就是它的完整的三维结构 蛋白质在体内的形成分为两个阶段蛋白质在体内的形成分为两个阶段 多肽链的生物合成 新生肽链折叠 蛋白质折叠蛋白质折叠 由多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性天然蛋 白质的过程 结构模体结构模体 一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近 彼此按特定的几何排布 形成简单的组合 结构域结构域 二级结构和结构模体以特定的方式组合连接 在空间上可以明显区分的三级 折叠实体 称为结构域 结构域水平划分蛋白质结构域水平划分蛋白质 1 型结构 2 型结构 3 型结构 4 型 5 无规型 富含二硫键和金属离子型 为主要结构 增加蛋白质稳定性的途径增加蛋白质稳定性的途径 1 引进二硫键 替换甘氨酸 增加脯氨酸 2 稳定 螺旋 3 填充疏水内核 帮助折叠的蛋白质和酶帮助折叠的蛋白质和酶 1 分子伴侣 2 帮助正确二硫键形成的酶 3 催化脯 氨酸残基 cis trans 异构化的酶 目前较为系统和广泛使用的数据库目前较为系统和广泛使用的数据库 SCOP CATH DALI FSSD 和 DDD 3 蛋白质分子设计 多 大题 重点重点 蛋白质设计的目的蛋白质设计的目的 为蛋白质工程提供指导性信息 探索蛋白质的折叠机理 蛋白质分子设计层次蛋白质分子设计层次 序列分析 二级结构预测 同源蛋白质结构预测 蛋白质 突变体结构预测 蛋白质的性能预测和蛋白质分子设计六个部分 分子设计的分子设计的 5 个步骤个步骤 1 建立所研究蛋白质的结构模型 可通过 X 射线晶体学 二维核磁共振等测定 2 找出对所要求的性质有重要影响的位置 利用同一家族中的蛋白质的序列比 对 分析 找出重要位点 这是分子设计工作的关键 3 选择一系列的在 2 中所选出位点上改变残基所得到的突变体 一方面使 蛋白质可能具有所要求的性质 另一方面又尽量维持原有结构 尽量在同源结 构中此位点已有的氨基酸残基序列中进行选择 也要考虑残基的体积 疏水性 等性质的变化所带来的影响 4 预测突变体的结构 5 定性或定量计算优化所得到的突变体结构是否具有所要求的性质 蛋白质分子设计流程蛋白质分子设计流程 蛋白质分子设计的分类蛋白质分子设计的分类 按照改造部位的多寡分为三类 第一类为 小改 少数残基的替换 通过定位突变或化学修饰来实现 主要通 过定点突变技术或盒式替换技术 例 核糖核酸酶 T4 噬菌体溶菌酶 第二类为 中改 对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装 例抗体分子改造 第三类为 大改 即完全从头设计全新的蛋白质 蛋白质的功能设计蛋白质的功能设计 通过反向拟合天然蛋白质设计新的功能 键合及催化的从头设计 在全新蛋白质中引入结合位点 催化活性蛋白质的设计 膜蛋白及离子通道的设计 新材料的设计 蛋白质分子设计的意义蛋白质分子设计的意义 1 是我们深入全面理解蛋白质的结构规律功能的一个过程 目的在于是人工创 造出自然界中不存在的蛋白质分子 使其具有特定的特殊结构和功能 为人类 所利用 2 人类已经迈进蛋白质设计的时代 蛋白质分子设计有助于进一步揭示蛋白质 的结构原理以及结构与功能的关系 也有助于指导药物合成以及工业产品的设 计 筛选以及纯化蛋白质筛选以及纯化蛋白质 需要测定它们的序列 三维结构 稳定性 催化活性等 3 蛋白质的修饰和表达 名词解释 填空 重点重点 易错易错 PCR 技术原理技术原理 改变正常 PCR 反应体系中某些组分的数量或者质量 随即 引入错误碱基创造序列多样性的 DNA 文库 DNA 改组技术原理改组技术原理 靶基因酶切产生随机 DNA 片段 以 3 末端的片端为引物 和模板 随机互补结合并延伸 蛋白质侧链基团的化学修饰蛋白质侧链基团的化学修饰 修饰部位 蛋白质的侧链基团 修饰机制 选择性的试剂或者亲和标记试剂与侧链上的特定功能团发生化学反 应 修饰类型 巯基 氨基 羧基 二硫键 常见的克隆载体填空常见的克隆载体填空 质粒载体 噬菌体载体 黏粒载体 病毒载体 人工染色体载体等 表达载体的构建表达载体的构建 1 复制的起始点 2 选择性基因 3 启动子 4 核糖体结合位点 5 多克隆位点 6 转录终止序列 核糖体展示技术 定向进化筛选中的方法 核糖体展示技术 定向进化筛选中的方法 该技术是基于一种稳定的抗体 核糖体 mRNA 复合物的构象基础 抗体蛋白与它 的编码序列物理连接 抗体基因转录 产生许多 mRNA 分子 每一个代表着不 同抗体基因 mRNA 分子与细菌的核糖体孵育 然后 mRNA 翻译成蛋白质 每 个复合体展示一种不同的抗体 当经过一个含有靶标抗原的亲和柱子后 一些 能结合上去的复合体不会被洗去 该展示技术完全在体外完成 并且不需要克 隆就能完成大规模抗体库的构建 5 蛋白质的物理化学性质 稳定蛋白质三维结构的作用力稳定蛋白质三维结构的作用力 氢键 范德华力 疏水作用力和盐键 离子键 及共价二硫键 静电作用 6 蛋白质结构解析 蛋白质三维结构测定的方法 选择填空 蛋白质三维结构测定的方法 选择填空 1 X Ray 晶体衍射是主要的方法 优点 分辨率高 能精确确定生物大分子中 各原子的坐标 键长 键角 给出生物大分子的分子结构和构型 确定活性中 心的位置和结构 缺点 只能测定单晶 反映静态结构信息 无法测定溶 液中的信息 2 核磁共振技术 优点 可以在水溶液或有机相中研究生物大分子结构 研究 溶液条件的改变对生物大分子三维结构的影响以及生物大分子内部动力学的 特点 分辨率不高 目前 NMR 只能用于测定小分子和中型蛋白质的结构 3 其他重要方法 圆二色谱法 通过圆二色谱测定和计算能够了解生物大分子 在溶液状态下的二级结构 质谱 将样品转化为运动的气态带电离子 于磁 场中按质荷比 m z 大小分离并记录的分析方法 高灵敏度易操作性准确性 快速性很好的普适性 7 分离纯化与鉴定 名词解释 填空无大题 盐析盐析 蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出 透析透析 利用半透膜对溶液中不同分子的选择性透过作用 可以将蛋白质与其 他小分子物质分开 盐溶盐溶 蛋白质溶液中加入低浓度中性盐后 可使蛋白质溶液浓度增加 纯化步骤纯化步骤 1 选择实验材料 实验材料预处理 2 蛋白质的提取 3 蛋白质的粗 分级 4 蛋白质的细分级 5 蛋白质的鉴定 常用技术及原理常用技术及原理 1 离子交换层析 蛋白质是两性分子 利用蛋白质所带电荷种类数量不同和 带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层析方法 2 分子筛层析 也称为凝胶过滤 分子排阻层析 是以多孔性凝胶材料为支 持物 当蛋白质溶液流经此支持物时 分子大小不同的蛋白质所受到的阻 滞作用不同而先后流出 从而达到分离纯化的目的 3 亲和层析 亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离 蛋白质的一种层析方法 4 羟基磷灰石层析 主要成分是磷酸钙 5 电泳 蛋白质为两性电解质 在一定 PH 的条件下 不同的蛋白质带有不 同种类和数量的电荷 因此其在电场中的移动速度不同 从而把蛋白质分 开 这种技术即为电泳 8 蛋白质工程的应用 很少 基因工程基因工程 2 动植物细胞培养产酶 很少 2 微生物发酵产酶 多 酶生物合成的四种模式酶生物合成的四种模式 比较细胞生长与酶产生的关系 1 同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式 又称为生长偶联型 2 延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始 在细胞生长进入平衡 期后 酶还可以延续合成一段较长时间 3 中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始 而在细胞生长 进入平衡期以后 酶的生物合成也随着停止 4 滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始 其生物合成并大量积累 又称为非生长偶联型 4 酶的提取分离与纯化 细胞破碎细胞破碎 许多酶存在于细胞内 为了提取这些胞内酶 首先需要对细胞进 行破碎处理 酶的提取酶的提取 是指在一定的条件下 用适当的溶剂或溶液处理含酶原料 使酶 充分溶解到溶剂或溶液中的过程 沉淀分离沉淀分离 是通过改变某些条件或添加某种物质 使酶的溶解度降低 而从 溶液中沉淀析出 与其它溶质分离的技术过程 酶的提取方法 大题 酶的提取方法 大题 层析的方法 大题 层析的方法 大题 5 酶分子修饰 很少 无大题 酶分子修饰酶分子修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变 从而改变酶的某 些特性和功能的技术过程 酶分子修饰方法酶分子修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 共价 非共价 侧链 基团修饰 肽链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 酶分子的物理修饰 共价修饰共价修饰 有些酶 在细胞内其他酶的作用下 其结构中某些特殊基团进行可 逆的共价修饰 从而快速改变该酶活性 调节某一多酶体系的代谢通路 称为共 价修饰调节 6 酶 细胞 原生质固定化 大题小题都有 固定化酶固定化酶 是指固定在载体上并且在一定的空间范围内进行催化反应的酶 固定化酶优缺点 固定化酶优缺点 优点 不溶于水 易于与产物分离 可反复使用 可连续 化生产 稳定性好 缺点 固定化过程中往往会引起酶的失活 固定化酶的应用 固定化酶的应用 1 酶经过固定化后 比较能耐受温度及 pH 值的变化 可制成颗粒装成酶柱用 于连续生产 也可以制成酶膜 酶管等酶反应器 2 固定化酶作为生物催化剂主要用于生产精细的特殊化学品 药品 在食品 工业中由于生物催化剂较安全 也将得到广泛使用 同时 固定化酶用于各 种疾病的诊断 治疗及人工脏器 氨基酰化酶是世界上第一种用于工 业生产的固定化酶 例 高果糖浆生产 青霉素酰化酶转化 3 与能量转换器密切结合而成酶传感器 广泛应用于临床诊断 工业发酵 过程中控制和环境监测等 例 酶电极 7 酶的定向进化 名词解释 定向进化技术定向进化技术 模拟自然进化的过程 进行人工随机突变 并在特定的环境 条件下进行选择 使进化朝着人们所需要方向发展的技术过程 酶分子定向进化 酶分子定向进化 在模拟自然进化过程 在体外进行酶基因的人工随机突变 建立突变基因文库 在特殊环境下 定向选择得到具有优良催化特性的酶的 突变体的技术 8 酶的非水相催化 少量名词解释 必须水必须水 维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量