HIV基因的复制和逆转录.ppt

Doc Huang 生化案例讨论 1 问题讨论 HIV基因组的复制过程 参考章节 DNA的生物合成 RNA的生物合成 逆转录如何导致HIV基因突变 HIV基因突变的生物学意义 参考章节 DNA的生物合成 2 首先了解下 HIV的基因组结构及功能 3 4 一 HIV的基因组结构及功能 HIV基因组为单股正链RNA二倍体 每条RNA链长约9 8kb 两条链的5 端借氢键形成二聚体 与其他逆转录病毒相同 HIV的基因结构从5 端到3 端依次为5 LTR gag pol env 3 LTR 5 端有帽状结构m7G5ppp5GmpNp 3 端有polyA序列 除三个编码结构蛋白的基因gag pol env外 HIV还有较其他逆转录病毒更多的调节基因 regulatorygene 和附加基因 accessorygene 其编码的的调节蛋白在病毒的整个感染及复制过程中具有非常重要的作用 目前已发现至少有7种 tat rev nef vpr vpu vpx和vif 5 1 长未端重复序列 HIV基因组两端的长未端重复序列 longterminalrepeat LTR 不编码病毒产物 对于病毒基因表达的起始和调节至关重要 其上有许多细胞转录因子的结合位点 可分为调节单位 核心转录单位和反式激活效应元件单位 TAR 三个不同的调控功能区 6 2 Gag基因 gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白 经蛋白酶水解形成P17 P24核蛋白 使RNA不受外界核酸酶破坏 gag基因编码几种病毒核心蛋白 衣壳蛋白 7 3 Pol基因 Pol基因编码聚合酶前体蛋白 经切割形成蛋白酶 整合酶 逆转录酶 核糖核酸酶H 均为病毒增殖所必需 pol基因编码3种酶 反转录酶 蛋白酶和整合酶 8 4 Env基因 env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160 gp120和gp41 gp120含有中和抗原决定簇 已证明HIV中和抗原表位 在gp120V3环上 V3环区是囊膜蛋白的重要功能区 在病毒与细胞融合中起重要作用 gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连 gp41与靶细胞融合 促使病毒进入细胞内 实验表明gp41亦有较强抗原性 能诱导产生抗体反应 env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白 9 其他调节基因和附加基因 5 TaT基因编码蛋白可与LTR结合 以增加病毒所有基因转录率 也能在转录后促进病毒mRNA的翻译 6 Rev基因产物是一种顺式激活因子 能对env和gag中顺式作用抑制序去抑制作用 增强gag和env基因的表达 以合成相应的病毒结构蛋白 7 Nef基因编码蛋白P27对HIV基因的表达有负调控作用 以推迟病毒复制 该蛋白作用于HIvcDNA的LTR 抑制整合的病毒转录 可能是HIV在体内维持持续感集体所必需 10 其他调节基因和附加基因 8 Vif基因对HIV并非必不可少 但可能影响游离HIV感染性 病毒体的产生和体内传播 9 VPU基因为HIV 1所特有 对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少 10 Vpr基因编码蛋白是一种弱的转录激活物 在体内繁殖周期中起一定作用 11 二 DNA的反转录合成 Reversetranscription 12 中心法则 13 逆转录病毒和逆转录酶 14 逆转录病毒细胞内的逆转录现象 15 反转录病毒 RNA病毒 含有反转录酶反转录 在反转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程 反转录酶 以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA cDNA 的酶 16 1 反转录酶以tRNA为引物合成双链cDNA RNA指导的DNA聚合酶活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 RNAseH的活性 是指它能够从5 3 和3 5 两个方向水解DNA RNA杂合分子中的RNA 然而 反转录酶中不具有3 5 外切酶活性 因此没有校正功能 反转录酶有3种酶的活性 17 反转录酶的结构 18 2 反转录病毒在宿主细胞内的主要活动 一 反转录合成双链cDNA 二 双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒 原病毒或前病毒 存在于真核染色体中和反转录病毒RNA基因组相对应的双链DNA序列 19 反转录病毒RNA基因组和原病毒 20 反转录病毒RNA基因组转变为双链cDNA的途径 21 问题4 HIV基因组的复制过程 HIV的复制 swf 22 gag基因编码几种病毒核心蛋白 衣壳蛋白 pol基因编码3种酶 反转录酶 蛋白酶和整合酶 env基因编码插入病毒外膜磷脂双层中的糖蛋白 3 原病毒DNA转录产生病毒RNA 具有自我复制能力的反转录病毒基因组含有3个基因 23 直接翻译产生多蛋白Gag和Gag Pol 含有包装信号 因此构成完整的病毒基因组 大约一半初级转录产物经过剪接加工形成gag polmRNA和envmRNA 原病毒初级转录产物有3种重要功能 24 初级转录产物多蛋白Gag Pol 经过蛋白酶水解 可产生反转录酶 蛋白酶和整合酶 多蛋白Gag经过加工 生成4种病毒衣壳蛋白 env基因编码的Env蛋白 经过加工以后插入病毒外膜磷脂双层 这些病毒蛋白和病毒RNA基因组可以迅速组装成许多新的反转录病毒颗粒 4 病毒RNA经翻译和包装形成反转录病毒颗粒 25 简单地重温下HIV感染的过程 26 1 吸附及穿入 HIV 1感染人体后 病毒选择性的吸附于靶细胞的CD4受体上 病毒包膜发生构象改变 外膜糖蛋白gp120的V3区与宿主细胞的CCR5或CXCR4结合 引起跨膜糖蛋白gp41区段HIV 1感染人体后 病毒选择性的吸附于靶细胞的CD4受体上 病毒包膜发生构象改变 外膜糖蛋白gp120的V3区与宿主细胞的CCR5或CXCR4结合 引起跨膜糖蛋白gp41区段与靶细胞膜上的融合结构域发生融合 使病毒核衣壳穿入宿主细胞 与靶细胞膜上的融合结构域发生融合 使病毒核衣壳穿入宿主细胞 27 2 脱衣壳和逆转录 病毒进入细胞后包裹在病毒衣壳内的病毒RNA 在与亲环素结合的衣壳蛋白p24的辅助下出胞 这一过程对环孢菌素A敏感 紧接着病毒RNA利用自身逆转酶的RNA依赖的DNA聚合酶和RNA酶活性进行逆转录 最后合成病毒基因组的双链DNA分子 cDNA 28 3 cDNA变为DNA 环化cDNA在环化酶的作用下形成以共价或非共价结合的双链环状DNA分子 其中非共价结合的环状DNA是整合到宿主染色体上的形式 抗病毒药对此无效 大多数新合成的病毒DNA以游离 非整合的共价结合的环状DNA形式保留在细胞浆内 它没有转录作用 但有致病理变化作用 抗病毒药对以这种形式存在的病毒有效 可使病毒载量下降 29 4 转录出正链RNA cDNA插入细胞基因组成为前病毒 然后以前病毒为模板 转录出正链RNA 即为病毒基因组 30 问题5 逆转录如何导致HIV基因突变 HIV基因突变的生物学意义 31 一 多种因素通过不同形式可引起DNA损伤 碱基开环和糖苷键断裂引起碱基丢失辐射或氧化损伤等引起碱基改变化学因素可引起核苷酸插入或缺失辐射和化学损伤可引起DNA链断裂物理和化学因素可引起DNA链间或链内交联 32 二 DNA损伤的结果 其一 导致复制或转录障碍其二 导致复制后产生基因突变 33 遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变 均可称为突变 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤 DNAdamage 从分子水平来看 突变就是DNA分子上碱基的改变 三 突变 34 四 突变的意义 一 突变是进化 分化的分子基础 二 突变导致基因型改变 三 突变导致死亡 四 突变是某些疾病的发病基础 35 五 HIV的高突变率 HIV的突变率极高 基因组的点突变每天都可发生 导致HIV频发表位突变 HIV为逆转录病毒 反转录酶中不具有3 5 外切酶活性 因此没有校正功能 DNA损伤修复能力较差 所以由反转录酶催化合成的DNA出错率比较高 因而HIV的变异频率非常高 每一轮复制都会引入约10个碱基的错误 36 六 HIV基因突变的生物学意义 高的变异频率使世界不同地区甚至同一感染个体不同时期HIV的基因组都有较大差异 即产生许多HIV的亚型 37 HIV的亚型及分布 根据HIVgag和env区的基因序列 目前HIV 1可分为M N和O三个进化组 两个进化组之间序列的异质性超过45 依据env区序列 M组又可分为A J10个亚型 亚型之间序列的异质性为30 A和D亚型主要见于中非 B亚型见于北美 欧洲