通过深焦磷酸测序揭示不同连作跨度香草土壤对微生物群落成员和结构的显著影响

通过深焦磷酸测序揭示不同连作跨度香草土壤对微生物群落成员和结构的显著影响 摘要 摘要 在本研究中 通过 16S 核糖体深焦磷酸测序 RNA rRNA 基因内转录间隔区 ITS 对香草连作时间域的土壤细菌和真菌群落进行了评估 结果表明 香草的长期连作 显著改变土壤微生物群落 土壤真菌多样性指数随连作年数增加 而土壤细菌多样性的比 较 稳定 布雷柯蒂斯相异聚类和 UniFrac 加权主坐标分析 PCoA 显示连作时间是真菌群 落结构的主要决定因素 但不适合细菌群落结构 随着香草单作的年份增加 厚壁菌门 放线菌 拟杆菌门 担子菌门的相对丰度 RAS 被耗尽 在门的水平皮尔森相关表明放 线菌 装甲菌门 拟杆菌门 疣微菌门 厚壁菌门与香草病情指数 DI 有显著负相关 而对真菌无显著相关性 此外 尖孢镰刀菌的数量积累随着年份增加 香草数据项显著正 相关 相反的是 有益细菌包括慢生根瘤菌和芽孢杆菌的数量显著降低 总之 长期连作 使土壤变弱和香草干枯萎病后 并可归因于变化土壤微生物群落的成员和结构 即 有益 微生物的减少和病原真菌的积累 关键词关键词土壤细菌和真菌群落 连作 香草 枯萎病 焦磷酸测序 前言 连作是生产实践中年复一年的在同一块地种植相同的土壤作物 可能诱发不同作物的 特定微生物群落 在一年生作物中通常导致产量下降 植物土传病菌富集 多年生植物通 常生长缓慢和不稳定 再植时会遭遇连作障碍 香草是多年生草本藤蔓植物 具有很高的经济价值 在热带和亚热带地区已广泛种植 然而 由于长期单一种植 已有香草种植国报道各类品种产生了土传病原真菌 在香草种植区发生了许多毁灭性的 分布广泛的疾病 特别是由尖孢镰刀菌引起的香草茎 和根腐病等 在中国 这种病使最长期单一种植香草的田野受到了灾害 造成巨大的经济 损失 对于维护土壤健康 土壤微生物是非常重要的 许多研究表明 土壤微生物群落受各种因 素的影响 包括植物 土壤类型 有机添加物 农业管理等 最近 越来越多的研究推测连作导致土壤微生物群落的成员和结构中断 此外 在连 作农业机制下真菌病原菌容易积累 然而 连作对土壤微生物群落以及土壤病的具体影响 仍不清楚 特别是在热带地区 在不同热带作物包括香草的土壤微生物群落的变化很少有 研究并被记录 据我们所知 赵某等人报道 香草根际土壤可培养细菌数量随香草连作时 间下降 而真菌数量随着时间的推移而增加 6S 核糖体 RNA rRNA 和 18S rRNA 基因 文库建设和变性梯度凝胶电泳 DGGE 方法在过去主要用于连作体系下的土壤微生物群 落研究 然而 只有一定的优势微生物菌群才可以使用这些方法检测到 的发展 如 454 焦磷酸测序在短时间内提供了一个低价格 高精度 高通量的研究土壤微生物多样性和群 落结构的方法 最近 下一代测序技术已广泛应用于农业中对土壤微生物细菌和真菌群落 的研究 许多研究所使用的下一代测序技术都集中在连作系统中土壤真菌或土壤细菌群落 有针对性的单一实验 在这项研究中 通过 FLX 454 测序技术利用 V4 V5 高变区域分别 对不同年长的香草种植土壤细菌和真菌群落的 16S rRNA 基因内转录间隔 its5 its4 作为 细菌和真菌的条码 标记 本研究的目标是 1 比较取自四组具有完全不同生产能力 不同时间跨度的香草 土壤细菌和真菌群落的组成和结构 2 探索与香草枯萎病相关的潜在的微生物群落 材料和方法材料和方法 实验地点描述和取样 实验地点位于海南省兴隆市中国科学院热带农业科学院热带饮料和热带香料研究所 110 20 E 18 73 n 具有热带季风气候 平均温度和降水量分别为 24 5 C 和 2201 毫米 不同时间跨度的香草品种农艺管理 施肥制度相似 土壤样品采自连续 1 6 11 21 年种植香草的田 并分别标记为 a b c 和 d 除去香草 植物和表面覆盖物后每个时间域分别随机采集 45 个点 0 20 厘米深和直径 2 5 厘米 15 个点的样品随机混合 每个时间域三重复 全部的 12 个土壤样品放进无菌塑料袋保 存在实验室冰箱里 通过 2 毫米筛彻底筛选均匀后 每个样品的一部分风干作为化学分析 其他部分的存储在 70 C 用于以后的 DNA 提取 土壤理化性质的测定 土壤水悬浮液 1 5 w v 摇匀后 30 分钟分别采用玻璃电极 pH 计和电导率仪测定土壤的 pH 值和电导率 EC 分别采用重铬酸钾外加热法和碱解扩散法测定有机物 OM 和有 效氮 水解性氮 有效磷从碳酸氢钠钠离子提取 采用钼蓝方法确定 采用火焰光度法 确定从醋酸铵中提取有效 k 的含量 使用醋酸提取并用原子吸收分光光度计测定钙镁在土 壤中的可交换性 采用盆栽试验综合评价土传疾病 基于目测观察香草的四个时间域 我们发现随着连作的年份增加阻碍了香草的生长 然而 不能得到每块地准确的枯萎病的病情指数 因为香草是土地出现病株后再植的 从香草四 个时间域通过盆栽试验对各自的田间土壤疾病进行评估 并确认结果 有 5 节 65 5 厘 米 的香草茎被选定为扦插苗 吴雄等三人的扦插苗种植在一盆 12 公斤土 每个时间 序列进行三次重复 每次重复含三个盆里的九株香草扦插苗 所有的花盆随机放置在海南 省兴隆市热带农业科学院里的温室 2013 年从四月到六月平均温度 30 C 和平均湿度 72 在 2 个月里 没有使用化肥 每 3 4 天进行灌溉保持土壤水分含量 疾病指数根据 DI 患病植株数 疾病严重程度指数 总的调查植株数 最高疾病严重程度指数 100 计算 疾病严重程度指数 DSI 0 5 是参考根据徐等人的方法并做出一些修改 其中 0 没有任何明显的症状的健康香草茎 1 1 至 25 的茎变色 2 26 到 50 茎变 色 3 51 到 75 茎变色 4 76 to 99 茎变色 5 植株完全死亡 DNA 提取和 PCR 扩增 使用 DNA 提取试剂盒 Mobio 实验室 卡尔斯巴德 美国 按照使用说明提取每块地的 微生物总 DNA DNA 的浓度和质量 A260 A280 的比值 采用分光光度计测定 从土壤 中提取的 DNA 作为 16S rRNA 基因的模板和 ITS 的扩增区域 细菌引物为 515f 5 gtgcca GCMGCCGCGG 3 和 907R 5 CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 3 用于扩增 400 bp 片段 生成 V4 到 V5 细菌 16SrRNA 基因的高变区 真菌特异性引物 ITS5 5 ggaagt aaaagtcgtaacaagg 3 和 ITS4 5 tcctccgcttattgatatgc 3 用于扩增 600 bp 真 菌内部可转录间隔区的片段 PCR 扩增是一个 25 L of 10 2 5 L 的反应 10 个 2 5 l 反应缓冲液 每个引物 10 m 2 5 mM dNTPs 40ng 的模板 0 625 单位的 Takara 探 针 扩增步骤如下 16SV4 V5 rRNA 基因在 94 C 变性 4 分钟 随后 25 次变性 94 30 S 退火 55 C 45S 延伸 72 1min 最后的延伸在 72 C 下 7 分钟 内转录间隔区基因在变性开始 4 分钟时保持 94 然后进行 35 次变性 94 30 S 退 火 50 45 S 延伸 72 C 1 min 和最后的扩展在 72 下进行 7 min 同时进行 三个样品的扩增 然后把产物汇总 然后使用 PCR 试剂盒将所有样品的产物纯化 每个 样品的扩增产物合并在一支管中 PCR 乳液用作 454 焦磷酸测序所要求的单链上的念珠 在 454 GS FLX 上测序仪进行焦磷酸测序 焦磷酸测序数据处理 按照 Schloss SOP 使用 Mothur v 1 25 1 进行细菌序列分析 均聚物中长度等于或大于 8 bp 小于 200 bp 模棱两可的序列可从数据集中去除 然后基于特异的 7 bp 片段过滤片段分配 到土壤样品中 去除引物序列和片段后 特异序列使用 Silva 106 数据库进行对比 通过 筛选 过滤 预聚类分析 和嵌合体的去除等过程 用其余序列构建一个 0 2 阈值的距离 矩阵 用平均相邻算法 97 相似截断 将这些序列聚类为操作分类单元 从每个 OTU 具有代表性的序列中使用 Bayesian 60 置信度 方法进行分类 真菌序列使用 Mothur v 1 25 1 进行第一步质量控制 允许不超过两个错配的正向引物 序列 码序列不超过一个错配 均聚物不超过八个核苷酸 其余的序列基于条码被分配到 每个土壤样品 使用 ITS Extractor v 1 1 从真菌 ITS 数据集中提取全长的 ITS1 分区 因 为碎片的存在可能会使聚类和相似搜索出现误差 过滤后使用 CAP3 对 ITS1 区域片段进 行下一步的校准 使用最小重叠的 100bp 将 OTU 分配在 97 鉴别水平 最终 使用 UNITE 和 INSD 数据库确定 OTU 代表序列 OTU 具有 97 的序列相似性时 使用 UNITE 和 INSD 数据库无法确定的 用 NCBI 数据库进行 BLAST 搜索 值得注意的是 单个 OTU 在全部 12 个样本中 只包含一个序列 下游分析被拆除 了 统计分析 对于所有的参数 单因素方差分析使用 Turkey s HSD 进行多重范围测试比较 微生物分 类群丰度 土壤性质及所有的门与香草干腐病 DI 的皮尔逊相关系数使用 SPSS 计算 所 有分析的 多样性使用 3 临界值差异度进行 OTU 聚类 结果结果 随着香草连作年份增加 土壤有机物质 有效磷 可交换性钙含量 PH 值显著增加 而 土壤电导率 EC 和可交换性镁含量显著降低 香草盆栽实验中 茎腐病病情指数随着连作年份显著增加 连作 21 年的土壤几乎没有生 长香草 在所有样品中占主导地位的细菌门为变形菌门 35 98 酸杆菌门 26 28 拟杆 菌门 6 99 厚壁菌门 3 06 2 04 土壤放线菌 1 45 与硝化螺旋 菌 1 43 相对丰度 RA 1 占主导地位的真菌为串珠状赤霉 17 06 马勃 8 41 Ceratocysti sparadoxa 4 96 尖孢镰刀菌 3 93 头孢叉状亚属 1 3