流式常用试剂配制

一 流式细胞术常用试剂一 流式细胞术常用试剂 1 10 NaN3 将 10gNaN3 溶解于 100ml 蒸馏水中 室温保存 活体实验或在辣根过氧化 酶反应中可不使用 NaN3 2 3 BSA PBS 100ml PBS 中加入 3g BSA 使之溶解 再加入 0 2ml 10 的 NaN3 3 500mmol L EDTA 将 186g EDTA Na2 2H2O 溶解于 400ml 蒸馏水中 用 NaOH 将 PH 调至 8 0 补充蒸馏水至 500ml 分装 高压灭菌 室温保存 4 4 多聚甲醛 在磁力搅拌下 将 4g 多聚甲醛溶于 100ml PBS 加入数滴 NaOH 在通 风柜中于 60 度加热 使其溶解 调整 PH 至 7 4 使用前新鲜配制 5 消化液 0 25 胰蛋白酶 用培养液或 PBS 配制 或 0 25 胰蛋白酶与 0 02 EDTA 的混合液 6 红细胞裂解液 NH4Cl 4 16g KHCO3 0 5g EDTA 2Na 0 02g 溶于 100ml 水中 调 PH 至 7 2 补充蒸馏水至 500ml 4 度储存 使用时需恢复至室温 7 流式细胞抗体稀释剂 0 1mmol L PBS 液 PH 7 4 1 BSA 0 1 Na2N3 8 常用细胞破膜剂 PBS 液 PH 7 4 1 FBS 或 BSA 0 1 NaN3 0 1 saponin Sigma 的效果不错 9 流式细胞染色洗涤液 含 2 的 BSA 0 1 NaN3 的 PBS PH 7 4 10 PI 染液 保存液 10 用于细胞周期和凋亡检测 10mg PI 溶于 10ml PBS 加入 2mg 无 DNA 酶的 RNA 酶 4 度保存备用 应用时 10 倍稀释 每管加 0 3ml 0 5ml PI 染液 11 Hanks 液的配制 BSS 主要用于培养液 稀释剂和细胞清洗液 不能单独作为细胞 组织培养液 原液 A NaCl 160g MgSO4 7H2O 2g KCl 8g MgCl 6H2O 2g CaCl2 2 8g 溶于 1000ml 双蒸水 原液 B 1 Na2HPO4 12H2O 3 04g KH2PO4 1 2g 葡萄糖 20 0g 溶于 800ml 双蒸水 2 0 4 酚红溶液 取酚红 0 4g 置玻璃研钵中 逐滴加入 0 1N NaOH 并研磨 直至完全溶 解 约加入 0 1N NaOH 10ml 将溶解的酚红吸入 100ml 量瓶中 用双蒸水洗下研钵中残留 的酚红液 并入量瓶中 最后补加双蒸水至 100ml 将 1 液和 2 液混合 补加双蒸水至 1000ml 即为原液 B 应用液 原液 A 1 份 原液 B 1 份 双蒸水 18 份 混合后 分装于 200ml 小瓶中 高压灭菌 临用前用无菌的 5 6 NaHCO3 调 PH 至 7 2 7 6 12 磷酸盐缓冲液的配制 PB A 液 0 2mol L NaH2PO4水溶液 NaH2PO4 H2O 27 6g 溶于蒸馏水中 稀释至 1000ml B 液 0 2mol L Na2HPO4水溶液 Na2HPO4 7H2O 53 6g 加蒸馏水溶解 加水至 1000ml 不同 PH 值 PB 的配制 A 液 xml 参照下表 中 加入 B 液 yml 为 0 2mol L 的 PB 若再加蒸馏水至 200ml 则 成 0 1mol L PB PH x ml y ml 5 7 93 5 6 5 5 8 92 0 8 0 5 9 90 0 10 0 6 0 87 7 12 3 6 1 85 0 15 0 6 2 81 5 18 5 6 3 77 5 22 5 6 4 73 5 26 5 6 5 68 5 31 5 6 6 62 5 37 5 6 7 56 5 43 5 6 8 51 0 49 0 6 9 45 0 55 0 7 0 39 0 61 0 7 1 33 0 67 0 7 2 28 0 72 0 7 3 23 0 77 0 7 4 19 0 81 0 7 5 16 0 84 0 7 6 13 0 87 0 7 7 10 0 90 0 7 8 8 50 91 0 7 9 7 00 93 0 8 0 5 30 94 7 13 PBS 的配制 配制 PBS 只要在相应的 PB 基液中加入 8 5g L NaCl 即可 二 常用激活剂二 常用激活剂 1 激活剂 PMA 用 DMSO 配制成 0 1mg ml 分装 20ul 管 20 度保存 勿反复融冻 实验时用无菌 无叠氮钠 PBS 1 100 稀释储存液 终浓度为 20ng ml 2 激活剂离子霉素 用乙醇配制成浓度为 0 5mg ml 的储存液 20 度保存 实验时用无 菌 无叠氮钠 PBS 1 10 稀释储存液 终浓度为 1ug ml 3 Staphylococcal enterotoxin B SEB 用无菌无叠氮钠 PBS 调节浓度 0 5mg mL 4 储 存 SEB 终浓度 10ug mL 4 CD3 包被在培养板中 在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞 5 CD28 加速不同刺激剂 包括 SEB CD3 等 的活化效应 浓度一般为 10ug ml 6 阻断剂 Bregeldin A 用 DMSO 配制成浓度为 5mg ml 的储存液 分装 20ul 管 20 度 保存 勿反复融冻 实验时用无菌 无叠氮钠 PBS 1 10 稀释储存液 在激活过程最后 4 5 小时使用 BFA 终浓度为 10ug ml 7 阻断剂莫能菌素 用 DMSO 配制成浓度为 1mg ml 的储存液 4 储存至少 4 个月 实 验时用无菌 无叠氮钠 PBS 1 10 稀释储存液 终浓度为 2umol L 三 常用抗体标记荧光染料的特性及其应用三 常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1 FITC 激发波长 488nm 最大发射波长 525nm 1 其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪 2 在流式细胞仪的 FL1 通道检测 3 可用于荧光显微镜技术 4 荧光强度易受 PH 值影响 PH 值降低时其荧光强度减弱 2 Alexa Fluor 488 激发波长 488nm 最大发射波长 519nm 1 其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪 2 在流式细胞仪的 FL1 通道检测 3 具有超乎寻常的光稳定性 非常适用于荧光显微镜技术 4 在较宽的 PH 值范围内保持稳定 PH4 10 3 Cy3 激发波长 488nm 最大发射波长 570nm 1 其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪 2 在流式细胞仪的 FL2 通道检测 3 适用于荧光显微镜技术 4 为小分子染料 非常适合需小分子染料的流式细胞术 荧光强度低于 PE 4 Cy5 激发波长 633 635nm 最大发射波长 670nm 1 其标记的抗体适用于所有配备 633nm 氩离子激光器的流式细胞仪 2 在流式细胞仪的 FL4 通道检测 3 适用于荧光显微镜技术 4 同样为小分子染料 非常适合需小分子染料的流式细胞术 荧光强度低于 APC 5 与单核和粒细胞非特异性结合多 易出现假阳性结果 5 PE 激发波长 488nm 最大发射波长 575nm 1 其标记的抗体适用于所有配备 488nm 氩离子激光器的流式细胞仪 2 在流式细胞仪的 FL2 通道检测 3 其荧光泯灭性强 不适用于传统的荧光显微镜技术 但适用于激光共聚焦显微镜技术 6 PE TR 激发波长 488nm 最大发射波长 615nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL3 通道检测 2 可适用于小功率激光器的流式细胞仪 也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪 7 PE Alexa Fluor 610 激发波长 488nm 最大发射波长 628nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL3 通道检测 2 荧光强度高 3 可适用于小功率激光器的流式细胞仪 也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪 8 PE Alexa Fluor 647 激发波长 488nm 最大发射波长 668nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL4 通道检测 BD 细胞仪 FL3 通道检测 2 不易湮灭 3 可适用于小功率激光器的流式细胞仪 也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪 9 PE Cy5 激发波长 488nm 最大发射波长 670nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL4 通道检测 BD 细胞仪 FL3 通道检测 2 可适用于大 小功率的流式细胞仪 3 淬灭性强 不适用于传统的荧光显微镜技术 4 可与 FITC PE 搭配 荧光干扰小 补偿小 但不宜与 APC 搭配 5 与单核细胞和粒细胞非特异性结合多 10 PE Cy5 5 激发波长 488nm 最大发射波长 694nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL4 通道检测 BD 细胞仪 FL3 通道检测 2 可适用于大 小功率的流式细胞仪 3 淬灭性强 不适用于传统的荧光显微镜技术 4 可与 FITC PE APC 搭配 荧光干扰小 补偿小 是 APC 比较理想的搭配 11 PE Alexa Fluor 700 激发波长 488nm 最大发射波长 723nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL4 通道检测 BD 细胞仪 FL3 通道检测 2 光淬灭性很强 要绝对避光 12 PE Cy7 激发波长 488nm 最大发射波长 767nm 1 在 Beckman Coulter 流式细胞仪的 FL4 通道检测 BD 细胞仪 FL3 通道检测 2 可适用于大 小功率的流式细胞仪 3 光淬灭性很强 要绝对避光 4 可与 FITC PE 搭配 与 FITC 无光谱重叠 与 APC 搭配荧光干扰小 补偿小 是比较 理想的搭配 13 TR 激发波长 595nm 最大发射波长 615nm 1 其标记的抗体适用于配备 Texas Red 激光器的流式细胞仪 2 荧光不易淬灭 可用于荧光显微镜 14 APC 激发波长 633 635nm 最大发射波长 660nm 1 其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪 2 在 BD 细胞仪的 FL4 通道检测 在 Beckman Coulter 细胞仪只有配备双激光器的 FC500 才能