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2020 3 28 1 第二章 微生物分类与鉴定 2020 3 28 2 主要内容 一 微生物的分类单位二 微生物的命名三 微生物分类的依据四 分类的方法五 微生物的鉴定六 微生物的常用分类系统 2020 3 28 3 一 微生物的分类单位1 微生物分类的目的 把各种微生物按照它们的亲缘关系分群归类 排成条理清楚的系统 以便于人们对微生物进行鉴定和交流 2 微生物分类的任务 分类 通过收集大量描述有关个体的文献资料 经过归纳 整理成一个科学的分类系统 鉴定 通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种性状特征 然后查找现成的分类系统 以达到对其知类 辨名的目的 命名 是为新发现的微生物确定新的学名 2020 3 28 4 3 通用分类单元 种以上的系统分类单元界Kingdom 拉 Regnum 门Phylum 拉 Phylum 或Division 拉 Divisio 亚门纲Class 拉 Classis 亚纲 超目目Order 拉 Ordo 亚目科Family 拉 Familia 亚科 族 亚族属Genus 拉 Genus 种Species 拉 Species 2020 3 28 5 4 种的概念 种是一个基本分类单位定义 种是一大群表型特征高度相似 亲缘关系极其接近 与同属内其他种有明显差异的菌株的总称 或定义亲缘关系较近的微生物有机体的集合 它们在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征 现代分类学上规定种内菌株的DNA同源性 70 模式种 在微生物中 一个种只能用该种内的一个典型菌株作为具体标本 它就是该种的模式种 新种 sp nov 或nov sp 新被鉴定的种发表时应在其学名后标上sp nov 的符号 新种发表前应将其模式菌株的培养物存放在一个永久性的保藏机构 并应允许人们从中取得 2020 3 28 6 亚种 小种race subspecies 实验室中获得的微生物变异型称为小种或亚种 或定义 一般指其某一稳定的特征的种与模式种中不同的种 常在种名 属名的名词后写上subsp 然后再写具体亚种的名词 变种 variety 从自然界分离到的微生物纯种 如果与典型种之间存在某些特征的差别 而这些特征又是稳定遗传的 则可将这一纯种称为典型种的变种 如枯草芽孢杆菌的黑色变种 在酪氨酸培养基上产黑色素 是亚种的同义词 1975 已规定它在命名法中没有地位 5 种以下的分类单元 2020 3 28 7 菌株 品系 strain 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖而成的纯种群体极其一切后代 一种微生物的每一不同来源的纯培养物或纯分离物均可称为某菌种的一个菌株 某一菌种内的菌株数目几乎是无数的 菌株的名称可用字母加编号表示 字母多表示实验室 产地或特征等的名称 编号则表示序号等数字 例如 BacillussubtilisAS1 398表示枯草芽孢杆菌的蛋白酶生产菌株 AS 为AcademiaSinica 中国科学院 的缩写 又如 BifidobacteriumbifidumATCC29521表示两歧双歧杆菌一个模式菌株 ATCC 为AmericanTypeClutreCollection 美国典型菌种保藏中心 的缩写 2020 3 28 8 型 typeorform 自然界存在的差异较小的同种微生物的不同类型 称为型 如结核分支杆菌依其寄主的不同可分为人型 牛型和禽型 菌株的同义词 群 group 有些微生物的特征介于两种微生物之间 我们把这两种微生物及其中间类型统称为一个群 没有分类地位非正式地指定一组具有某些共同性状的生物 如大肠菌群 相 phase 自然界存在的微生物交互变异的一定阶段 态 state 通常指微生物的菌落变异状态 2020 3 28 9 二 微生物的命名 1 学名 scientificname 按照 国际细菌命名法规 命名的 国际学术界公认并通用的正式名字 命名的方法 国际法规命名 即林奈氏所创立的双 三 名法 双名法的规则 学名 属名 种名加词 首次定名人 现名定名人和鲜明定名年份由两个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成 属名 genericname 为名词 单数 开头字母大写 是该微生物的主要特征 种名加词 specificepithet adj 首字小写 为形容词 是该微生物的次要特征 在出版物中用斜体 书写时在学名下划横线以表示斜体 2020 3 28 10 例1 大肠埃希氏杆菌 简称大肠杆菌 Escherichacoli Migula CastellanietChalmers1919例2 枯草芽孢杆菌 简称枯草杆菌 Bacillussubtilis Ehrenberg Cohn1872例3 金黄色葡萄球菌 StaphylococcusaureusRosenbach1884出现在分类学文献中的学名 在此两者之后往往还加上3项内容 即首次定名人 正体字 用括号括住 现名定名人 正体字 和现名定名年份 但一般情况下省去 2020 3 28 11 林奈氏双名法 属名十种名加词十 首次命名人 现命名人十首次命名年份拉丁字或希腊字或拉丁化了的其他文字组成首字母大写首字母不大写名词形容词主要特征次要特征斜体斜体 正体 正体正体如Aspergillusniger曲霉黑色的黑曲霉Streptococcus链条球状菌链球菌在出版物中用斜体 书写时在学名下划横线以表示斜体 2020 3 28 12 林奈氏三名法 当某种微生物是一个亚种或变种时 学名就应按三名法拼写 即在双名法学名后加写subsp或var 排正体 用括号括住 可省略 再加亚种或变种的加词 排斜体 不可省略 例1苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种 或称蜡螟苏云金芽孢杆菌 Bacillusthuringiensis subsp galleria例2酿酒酵母椭圆变种 椭圆酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae var ellipsoideus 2020 3 28 13 当前后两个或多个学名连在一起时 若它们的属名相同 则相连的一个或几个属名可缩写成一个 两个或三个字母 并在其后加上一个点 例如 Bacillus 芽孢杆菌属 可缩写成 B 或 Bac 在实际工作中 当菌种的最后鉴定尚未结束 此时其学名中的种名加词可以先用 sp 正体 species单数的缩写 或 spp 正体 species复数的缩写 来代替 例如 Bacillussp 可译为 一种芽孢杆菌 而 Bacillusspp 则可译为 若干种芽孢杆菌 或 一批芽孢杆菌 2020 3 28 14 2 俗名 commonname 普通的 通俗的 地区性的名字 具有简明和大众化的优点 但往往涵义不够确切 易于重复 使用范围局限 如绿脓杆菌 铜绿假单孢菌Pseudomonasaeruginosa白念菌 白色假丝酵母Candidaalbicans金葡萄 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus 2020 3 28 15 三 微生物分类的依据 1 经典分类鉴定依据 形态特征 个体形态 形状 大小 染色反应等 群体形态 菌落特征 在半固体或液体中培养特点等 生理生化特征 酶 代谢产物 种类 产量 显色反应等 营养要求 能源 碳源 氮源和生长因子等 细胞壁成分等的测定生态特征 微生物间各种相互关系的利用 生长温度 对氧的要求 宿主的种类等 遗传特征 DNA同源性分析G C的含量 mol 值 生活史特点 血清学反应 phage的敏感性 其它 全细胞蛋白的分析 多位点酶的分析等 2020 3 28 16 生理生化反应特征 1 利用营养物质的能力 包括对各种碳源 氮源的利用能力 能量的来源 对生长因子种类和数量的要求等 2 代谢产物的种类和特性 主要测定微生物在生长过程中产生的某类特殊的生成物 例如在细菌鉴定时常测定被检测菌是否产生H2S 吲哚 醇 有机酸 能否还原硝酸盐能否使牛奶凝固 胨化等等 由此产生的生化试验主要有 糖发酵实验 甲基红试验 methylredtest 简称M R试验 乙酰甲基甲醇试验 V P试验 靛基质试验 吲哚试验 硫化氢试验 硝酸盐还原试验 过氧化氢酶试验和氰化钾生化试验等 2020 3 28 17 2 现代分类依据 进化的测量指征 20世纪70年代以前 讨论进化主要涉及高等生物 有关微生物进化很少提及 进化指征的选择 形态学特征 微生物可利用的形态特征少 形态特征在不同类群中进化速度差异大 不准确 分析和比较生物大分子的结构特征 以蛋白质 DNA RNA作为主要指征 2020 3 28 18 微生物遗传型的鉴定 A DNA碱基比例的测定 主要是 G C mol 值B 核酸分子杂交 DNA DNA和DNA RNA杂交C 16SrRNA寡核苷酸编目分析D 氨基酸序列和蛋白质分析F 遗传重组真核生物以能否进行有性生殖定义物种 原核生物发生转化 转导 结合的物种间存在广泛的染色体同源性 2020 3 28 19 细胞化学成分鉴定 A 细胞壁的化学组成B 全细胞水解液的糖型 C 磷酸类脂的成分分析 D 枝菌酸的分析 E 醌类的分析 F 气相色谱技术的应用 现代分子生物学和免疫学技术的采用DNA探针 PCR DNA芯片 酶联免疫吸附测定 ELISA 免疫荧光技术 放射免疫技术 全自动免疫诊断系统 2020 3 28 20 核酸探针技术原理 两条不同来源的核酸链如果具有互补的碱基序列 就能够特异性的结合而成为分子杂交链 据此 将己知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记 加入己变性的被检DNA样品中 在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链 从而达到鉴定样品中DNA的目的 这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链叫DNA分子核酸探针或基因探针 制备核酸探针要注意两个关键性的问题 要选择特异性强而又无交叉反应的核酸 DNA或RNA 片段 可通过核酸重组和克隆以及人工合成 PCR扩增等技术获得 其次是标记物 当前常用同位素 32P 125I 35S等 光生物素及地高辛 digoxigenin 标记 2020 3 28 21 核酸探针技术已被用于检验食品中一些常见的病原菌 如产肠毒素性大肠杆菌 ETEC 是引起人和动物腹泻的主要病原之一 在常规食品的大肠杆菌检测时 产耐热肠毒素 ST 的大肠杆菌常用乳鼠试验来鉴定 该方法操作复杂 耗时多 不适于进行大样本的检测 并且所用增菌方法还常常导致质粒相关毒力的丧失 核酸探针技术特异 敏感而又没有放射性 且因不需要进行复杂的增菌和获得纯培养而节省了时间 减少了由质粒决定的毒力丧失的机会 从而提高了检测的准确性 另外在沙门氏菌的检测中 核酸探针技术也已被广泛使用 2020 3 28 22 PCR PolymeraseChainReaction 即聚合酶链式反应 又称为无细胞克隆系统 是1985年由Mullis创建的一项DNA体外扩增技术 PCR的全过程由变性 denature 退火 annealing 和延伸 extension 三步组成的若干个循环 每步之间通过温度的改变来实现转换 其基本原理是在体外对一特定的双链DNA片段 或称靶DNA 进行高效扩增 首先将靶DNA双链加热变性为单链 然后加入两段人工合成的与靶DNA两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物 primer 即左端引物和右端引物 该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后 在有DNA多聚酶和四种dNTPs底物存在的情况下 引物沿模板DNA链 靶DNA单链 按5 3 方向延伸 自动合成新的DNA双链 新合成的DNA双链又可作为扩增的模板 继续重复以上的DNA多聚酶链反应 在扩增初期 靶DNA分子呈几何级数2n n为循环次数 增加 随着循环次数增多 模板DNA的不断增加以及酶分子的逐渐消耗 扩增效率则下降 DNA分子呈线性 1 x n x为DNA分子的实际增长率 增加 经过25 35次循环 可将靶DNA序列扩增100万 200万拷贝 2020 3 28 23 PCR技术有快速 特异 敏感等特点 因而该技术在食品中致病菌的检测方面具有很大的应用潜力 如对食品中单核细胞增多症李氏杆菌的检测 过去一直缺乏简单快速的分离鉴定技术 克隆培养的标准方法往往需要3 4周的时间才能得出结果 免疫学技术 如ELISA等 检测时也存在着特异性 敏感性差等问题 采用PCR技术对食品中李氏杆菌的溶血O 基因进行扩增 结果可在12h内完成整个检测过程 且样品中只需要含有5 50个细菌即可被检出 又如PCR技术能快速地检出肉食品中的沙门氏菌 检测的敏感性和特异性均为100 保证了检测的准确性 PCR还可用于多种病原微生物的同时检测或鉴定 它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物 进行PCR扩增 可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染 2020 3 28 24 基因芯片 genechip 又称DNA微阵列 DNAmicroarray 是指将许多特定的寡居核苷酸片断或基因片段作为探针 有规律的排列固定于支持物上形成的DNA分子阵列 芯片与待测的荧光标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交后 在通过激光共聚焦荧光监测系统等对其表面进行扫描即可获取样品分子的数量和序列信息 它主要是基于近年来的一种全新的DNA测序方法之一杂交测序法应运而生的 由于该技术同时将大量的探针固定于支持物上 所以可以一次性对大量序列进行检测和基因分析 解决了传统的核酸印迹杂交 southernblot和northernblot等 操作复杂 操作序列数量少等缺点 基因芯片技术的突出特点在于其高度的并行性 多样化 微型化和自动化 以及灵敏 高效和低成本等优点 2020 3 28 25 免疫荧光技术 2020 3 28 26 酶联免疫吸附测定 2020 3 28 27 四 分类的方法 1 经典分类法 采用双歧法整理实验结果2 数值分类法 测定100项以上的各种性状 利用计算机进行菌株的相互比较 并得出总的相似值 一般认为同种微生物菌株之间的相似值 80 3 遗传分类法 DNA杂交 G C含量的测定 DNA分子中鸟嘌呤 G 和胞嘧啶 C 所占的摩尔百分比值 即 G C mol G C A T G C 100 热变性法 浮力密度法等 2020 3 28 28 分类学上目前主要采用较为间接的比较方法 核酸分子杂交 来比较不同微生物DNA碱基排列顺序的相似性进行微生物的分类鉴定 核酸杂交的具体测定方法很多 按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类 经典的方法是固相滤膜法 它需要放射性同位素 目前最常用的方法则是复性速率法 它不需要放射性同位素 操作简便 并有较好的重复性 通过核酸杂交技术可以明确界定细菌种 1987年国际系统细菌委员会规定 DNA相关性在70 以上 杂交分子的热解链温度相差小于5 作为种的界限 此外对于新菌种或表型性状差别很小而难以肯定的菌株做出较可靠的判定 并可以修正其他方法的分类和鉴定错误 例如 在沙门氏菌属 在运用了核酸杂交方法后 改变了该属原来一个血清型一个种的分类状况 2020 3 28 29 G Cmol DNA分子含有四种碱基 腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胞嘧啶 C 和胸腺嘧啶 T 双链DNA碱基配对规律是 A T和C G 然而不同的有机体 G C A T 的摩尔百分比却各不相同 但不同的有机体的G Cmol 均有较稳定的值 该值的含义为 G C G C A T 100 目前 虽然还没有一个统一的界定各级分类单元的G C含量标准 但大量数据表明 同一个种内的不同菌株的G Cmol 差别应在4 5 以下 同属不同种的G Cmol 差别应在10 15 以下 因此G Cmol 的测定已成为微生物分类鉴定工作的一个重要部分 测定G Cmol 的方法很多 常用的有热变性温度法 浮力密度法和高效液相色谱法 在细菌的分类中 由于热变性温度法操作简单 重复性好而最为常用 2020 3 28 30 G C含量的测定DNA分子中鸟嘌呤 G 和胞嘧啶 C 所占的摩尔百分比值 即 G C mol G C A T G C 100 热变性法 浮力密度法等 2020 3 28 31 数值分类法 即统计分类法 在200年前M Adanson 1727 1806 法国植物学家 发表的分类原理基础上结合现代计算机技术发展而来的 主要观点 在一个分类群中 其所含信息量越大 即分类所依据的性状越多 其分类效果也越好 顺序建立自然分类单元时 每个性状都是等权的 任何两分类实体间的整体相似性 都是由每一对的相似性计算而来的 能够由类群间相似性的差异识别不同的分类实体 如果给予有关进化途径和机制的某些假定 可以从组群的分类学结构或从性状相关上作出种系发生的推论 分类学应作为一门经验科学来看待和实践 数值分类学是以表象相似性为基础的 2020 3 28 32 数值分类的基本步骤 计算两菌株间的相似系数Ssm SJ 列出相似度矩阵将矩阵图转换成树状图 a da b c d aa b c 2020 3 28 33 2020 3 28 34 五 微生物的鉴定 1 主要步骤 纯化 测定一系列必要的指标 查找权威性鉴定手册2 鉴定技术的不同水平 细胞的形态和习性 形态特征 运动 酶反应 营养要求及生长条件等细胞组分水平 细胞壁成分 氨基酸库 脂类 醌类 光合色素等的分析蛋白质水平 氨基酸序列分析 凝胶电泳和血清学反应等基因或DNA水平 核酸分子杂交 DNA探针 PCR G C mol 转化和转导 16SrRNA寡核苷酸族分分析 DNA或RNA核苷酸序列分析等 2020 3 28 35 16SrRNA特点 WoeseC R之所以于1997年选择细菌的核糖体小亚基16SrRNA核苷酸序列作为研究原核生物系统发育的工具 是因其具备如下特点 16SrRNA存在于所有生物中并执行相同的功能 合成蛋白质 进化相对保守 分子序列变化缓慢 能跨越整个生命进化过程 具有生物分子计时器特点 素有细菌 活化石 之称 分子中含有进化带度不同的区域 可用于进化程度不同的生物之间的系统发育研究 16SrRNA非常适合作为研究生物进化和系统发育的工具 微生物的16SrRNA可从样品中直接提取 分析 比较其序列 进而确定其家族树中位置 克服了传统微生物学只能研究 可培养 微生物 许多古细菌目前还不能人工培养 也是依据这种方法分类的 2020 3 28 36 双滴虫 假滴虫属 生物总系统发育树 根据16SrRNA序列比较绘制 引自 布氏微生物学 2000 2020 3 28 37 微生物的快速鉴定和自动化分析技术 1 微量生化系统检测如商品化的API系统 API 20 Enterotube等鉴定系统 2 快速 自动化微生物检测仪器和设备 阻抗测定仪 放射测量仪 微量量热计 生物发光测定仪 药敏测定仪 自动微生物检测仪 2020 3 28 38 API系统 AnalytabProductsInc 酶作用物和指示剂 用蒸馏水制备 塑料板上有20个小杯 于35 20 24h取出观察颜色 据厂方提供的图表判定菌株的属种 API20E用于肠道菌检验 API20A鉴定厌氧菌 API20C鉴定酵母菌 APIzym鉴定链球菌放线菌和胨球菌等 API50鉴定API20E不能鉴定的菌株 2020 3 28 39 2020 3 28 40 Enterotube系统 分别装有不同酶作用物和指示剂 该装置可做下列15种试验 葡萄糖产酸产气 赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶 硫化氢 靛基质 乳糖和卫矛醇发酵 苯丙氨酸脱氨酶 尿素酶和柠檬酸盐 侧金盏花醇 阿拉伯糖 山梨醇和V P试验等试验 查阅专门设计的结果判定表 2020 3 28 41 2020 3 28 42 六 微生物的常用分类系统 细菌 伯杰氏细菌鉴定手册 第八 第九版 伯杰氏系统细菌学手册 第一版 普雷沃 法 细菌分类 放线菌 中国科学院微生物研究所编著的放线菌目分科 分属检索表 克拉西里尼可夫 前苏联 细菌放线菌分类手册 瓦克斯曼 美 放线菌分类 真菌 Smith Alexopoulos Ainsworth的分类系统 2020 3 28 43 伯杰氏细菌分类系统 伯杰氏细菌鉴定手册 是细菌分类系统的综合和标准 由美国细菌学家协会 现称美国微生物学会 发起编写的 最初指定DavidH Bergey作为编委会主席 在1923年出版了手册的第一版 相继在1925 1930 1934 1939 1948 1957 1994年出版了第二至第九版 成为国际上细菌学家普遍接受和采用 2020 3 28 44 1994年出版的 伯杰氏细菌鉴定手册 第九版几乎是 伯杰氏系统细菌学手册 的缩写本 除了对细菌各属关键表观特征描述外 属内种的鉴定特征以表格的形式出现 对于鉴定工作十分方便 鉴定手册包括35群细菌 2020 3 28 45 1984 1989年陆续出版的四卷册 伯杰氏系统细菌学手册 第一版 在着重于表观特征描述的基础上 结合化学分类 数值分类特别是DNA相关性分析 及16SrRNA寡核苷酸编目在生物种群间的亲缘关系研究中的应用作了详细的阐述 体现了细菌分类的研究从表观向系统发育体系的发展 除此 还附有每个菌群的生态 分离 保藏及鉴定的方法 2020 3 28 46 原核生物的多相分类 多相分类 polyphasictaxonomy 的概念最初由Colwell于1970年提出 指利用微生物多种不同的信息 包括表型的 基因型的和系统发育的信息 综合起来研究微生物分类和