高效液相色谱法大学ppt课件.ppt

第2章高效液相色谱法 highperformanceliquidchromatogrphyHPLC 第1节概述第2节HPLC的分类与基本原理第3节各类高效液相色谱法第4节固定相第5节流动相第6节高效液相色谱仪第7节定性 定量分析方法第8节应用与示例 第2章高效液相色谱法 第1节概述 一 基本概念与特点二 HPLC与经典LC GC的比较三 HPLC仪器结构 色谱法 Chromatography 是一种分离分析方法 是目前科研和生产分析中广泛采用的一种重要工具 一句话 色谱法非常有用 必须掌握 一 色谱法简介色谱法是1901年由俄国植物学家茨维特 Tswett 提出 最初的认识是在于它的分离价值 用于分离植物中的色素等有色物质 现代的色谱方法 不再局限于有色物质 也大量用于分离无色物质 一 基本概念 俄国植物学家茨维特使用的装置 色谱原型装置如图 用来分离植物叶片的色素 管子中的填充物固定不动 称为固定相 碳酸钙 将色素提取物置于管子上端 靠重力往下流 同时用石油醚淋洗 石油醚称为流动相 携带试样混合物流过固定相 管子及填充物可以称为色谱柱 色谱三元素 一 基本概念 概念 高效液相色谱法 HPLC 是在20世纪60年代末 以经典液相色谱为基础 引入了气相色谱的理论 在技术上采用了高效固定相 高压输液系统和高灵敏度的在线检测器 从而发展起来的一种新型分离分析技术 随着科学和技术的不断改进与发展 目前已成为应用极为重要 广泛的分离分析手段 特点 分离效率高 分析速度快 应用范围广 操作自动化 一 基本概念与特点 一 基本概念与特点 色谱基本参数与流出曲线的表征 1 基线 无试样通过检测器时 检测到的信号即为基线 2 保留值 1 时间表示的保留值保留时间 tR 组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间 死时间 tM 不与固定相作用的气体 如空气 的保留时间 调整保留时间 tR tR tR tM 保留体积 VR VR tR qvqv为柱出口处的载气流量 单位 mL min 死体积 VM VM tM qv调整保留体积 VR VR VR VM 2 用体积表示的保留值 3 相对保留值r21 相对保留值只与柱温和固定相性质有关 与其他色谱操作条件无关 它表示了固定相对这两种组分的选择性 4 区域宽度 衡量色谱峰宽度的参数 三种表示方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半 2 半峰宽 Y1 2 色谱峰高一半处的宽度Y1 2 2 354 3 峰底宽 Wb Wb 4 分配系数 partitioncoefficient K 组分在固定相和流动相间发生的吸附 解吸 或溶解 挥发的过程叫做分配过程 在一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的浓度 单位 g mL 比 称为分配系数 用K表示 即 分配系数是色谱分离的依据 分配系数K的讨论 一定温度下 组分的分配系数K越大 出峰越慢 试样一定时 K主要取决于固定相性质 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同 选择适宜的固定相可改善分离效果 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础 某组分的K 0时 即不被固定相保留 最先流出 3 分配比 partitionradio k 一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的质量比 1 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 随分离柱温度 柱压的改变而变化 2 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 数值越大 该组分的保留时间越长 3 分配比可以由实验测得 分配比也称 容量因子 capacityfactor 和容量比 capacityradio 塔板理论的假设 1 每一个平衡过程间隔内 平衡可以迅速达到 2 将载气看作成脉动 间歇 过程 3 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 4 每次分配的分配系数相同 色谱理论 塔板理论 柱分离效能指标 1 塔板理论 platetheory 半经验理论 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程 将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 动画 色谱柱长 L 虚拟的塔板间距离 H 色谱柱的理论塔板数 n 则三者的关系为 保留时间包含死时间 在死时间内不参与分配 理论塔板数与色谱参数之间的关系为 n L H色谱峰的方差 与柱长或保留时间的关系为 单位柱长的塔板数越多 表明柱效越高 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数 组分在tM时间内不参与柱内分配 需引入有效塔板数和有效塔板高度 有效塔板数和有效塔板高度 塔板理论的特点和不足 1 当L一定时 n越大 H越小 被测组分在柱内被分配的次数越多 柱效能则越高 所得色谱峰越窄 2 不同物质在同一色谱柱上的K不同 用n有效和H有效作为衡量柱效能的指标时 应指明测定物质 3 柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果 当两组分的分配系数K相同时 无论该色谱柱的塔板数多大 都无法分离 4 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果 也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径 色谱理论 速率理论 影响柱效的因素 1 速率方程 也称范 弟姆特方程式 H A B u C uH 理论塔板高度 u 载气的线速率 cm s 减小A B C三项可提高柱效 存在着最佳流速 A B C三项各与哪些因素有关 载气流速与柱效 最佳流速 载气流速高时 传质阻力项是影响柱效的主要因素 流速 柱效 载气流速低时 分子扩散项成为影响柱效的主要因素 流速 柱效 H u曲线与最佳流速 由于流速对这两项完全相反的作用 流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值 即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值 以塔板高度H对应载气流速u作图 曲线最低点的流速即为最佳流速 速率理论的要点 1 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散 浓度梯度所造成的分子扩散 传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因 2 通过选择适当的固定相粒度 载气种类 液膜厚度及载气流速可提高柱效 3 为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响 4 各种因素相互制约 载气流速增大 分子扩散项的影响减小 使柱效提高 但同时传质阻力项的影响增大 又使柱效下降 柱温升高 有利于传质 但又加剧了分子扩散的影响 选择最佳条件 才能使柱效达到最高 分离度 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度 即柱效为多大时 相邻两组分能够被完全分离 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响 保留值之差 色谱过程的热力学因素 区域宽度 色谱过程的动力学因素 色谱分离中的四种情况如图所示 讨论 色谱分离中的四种情况 柱效较高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 柱效较高 峰较窄 基本分离 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 分离度的表达式 R 0 8 两峰的分离程度可达89 R 1 分离程度98 R 1 5 达99 7 相邻两峰完全分离的标准 讨论 1 分离度与柱效分离度与柱效 n 的平方根成正比 r21一定 增加柱效 可提高分离度 但通过增加柱长来增加n使组分保留时间增加且峰扩展 分析时间长 2 分离度与r21增大r21是提高分离度的最有效方法 计算可知 在相同分离度下 当r21增加一倍 需要的n有效减小10000倍 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液 二 HLPC与经典液相色谱和气相的比较 高效液相色谱与经典液相色谱比较 二 HLPC与经典液相色谱和气相的比较 高效液相色谱与气相色谱比较 三 HPLC仪器结构 第2节HPLC的分类与基本原理 一 高效液相色谱法的原理 HPLC与经典LC和GC在基本原理 概念和方法基本上相同 主要差别是流动相的性质不同 因此 某些公式的表现形式或参数的含意有些差别 化合物的极性 电荷 分子大小 旋光性四种主要的性质可以用来产生高效液相色谱分离 1 VanDeemter方程式 流动相的流速对GC与HPLC板高影响的差别 HPLC的分离条件 采用粒径小而均匀的球形固定相 首选化学键合相 用匀浆法装柱 采用低黏度流动相 低流量 1mL min 首选甲醇 采用柱温箱 避免室温波动 增加实验重复性 柱温以25 30 为宜 二 高效液相色谱法的分类 详细分类图 三 各类高效液相色谱法 1 吸附色谱法 LSC 2 分配色谱法 LLC 3 化学键合色谱法 BPC 4 其他色谱法 1 吸附色谱法LSC 分离机理 吸附色谱法是被分离的组分分子 溶质分子 与流动相分子争夺吸附剂 固定相 表面活性中心 因溶质分子的吸附系数的差别而分离 影响容量因子 k 的因素 以硅胶吸附剂为例 1 吸附色谱法LSC 硅胶与溶质分子的亲和力顺序 kmin 饱和烃 芳烃 酯醛酮 羧酸 kmaxk大者后出峰 溶质的极性 常用流动相是以烷烃为底剂 加入适当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系统 从而能调整溶解的极性 控制组分的保留时间 溶剂系统的极性越大 洗脱力越强 2 分配色谱法 LLC 分离机理 分配色谱法是由于样品组分溶入固定相 s 与流动相 m 达到 平衡 后的分配系数的差别而分离 样品组分在固定相与流动相中的溶解度差别越大 K k差别也大 分离效果越好 正相液 液色谱法 NLLC 流动相极性小于固定相极性的LLC称为NLLC 正相洗脱时样品中极性小的组分先流出色谱柱 极性大的组分后流出色谱柱 反相液 液色谱法 RLLC 流动相极性大于固定相极性的LLC称为RLLC 反相洗脱时样品中极性大的组分先流出色谱柱 极性小的组分后流出色谱柱 3 化学键合色谱法 化学键合相 将具有官能团的固定相键合到载体表面 构成化学键合相 化学键合色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法 简称键合色谱法 bondphasechromtography 特点 既有分配作用 又有吸附性能 反相键合相色谱法 RBPC 正相键合色谱法 NBPC 离子对色谱法 IPCor PIC 离子抑制色谱法 ISC 其他色谱法 3 化学键合色谱法 反相键合相色谱法RBPC典型的反相键合色谱法 RBPC 是用非极性的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系 固定相常用十八烷基硅烷键合相 ODS或C18 流动相常用甲醇 水 乙腈 水 非典型反相键合色谱系统 用弱极性或中等极性键合相与极性大于固定相的流动相组成 3 化学键合色谱法 分离机理 反相键合相表面具有非极性烷基官能团和未被取代的硅醇级 分离机理较复杂 有疏溶剂理论 双保留机理 顶替吸附 液相相互作用模型等 疏溶剂理论 把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅胶表面上的十八烷基的 分子毛 它有较强的疏水特性 如图10 4所示 图10 4疏水剂缔合示意图 当用极性溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有机化合物时 一方面分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用 使它保留在固定相中 另方面被分离物的极性部分受到极性流动相的作用 促使它离开固定相 并减小其保留作用 结果两种作用力之差 决定了分子在色谱中的保留行为 流动相的极性与容量因子的关系 流动相极性增大 洗脱能力降低 溶质的k增大 tR增大 反之 k减小 tR也减小 作反相洗脱时 对于结构相近的组分 极性大的组分先出峰 正相键合色谱法 NBPC 固定相一般以氰基或氨基等极性基团作为键合相 流动相以烷烃 正己烷 中加入适量的极性调整剂 如氯仿 甲醇 乙腈等 为流动相 用途 主要用于分离极性不同的化合物 异构体 特别适用于分离不同类型的化合物 正相键合色谱法 分离机理 主要靠组分分子与固定相之间的范德华力 氢键作用力的差别而进行分离 流动相的极性与容量因子的关系 作正相洗脱时 流动相的极性增大 洗脱能力增加 k减小 tR减小 反之 k与tR增大 分离结构相近的组分时 极性大的组分后出峰 正相键合色谱法 离子对色谱 ionpairchormatography IPC 在流动相中加入与被测离子相反电荷的离子对试剂 使之形成中性的离子对化合物 从而增加样品离子在非极性固定相中的溶解度 使分配系数增加 分离改善 分配系数的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度 离子对色谱法 常用离子对试剂 分离碱类 用烷基磺酸盐为离子对试剂 如十二烷基磺酸钠 正戊 己 庚 辛磺酸钠 PIC B5 6 7 8 等 分离酸类 用四丁基季铵盐 PIC A 如四丁基胺磷酸盐 TBA 等 离子对色谱法 分配系数 主要用途 有机酸碱盐的分离 避免流动相 酸碱 对泵和流路的腐蚀 药物分析 如生物碱 有机酸 磺胺类药物 某些抗生素和维生素 体内药物分析等 缺点是价格昂贵 离子对色谱法 在反相色谱法中 通过调节流动相的pH值 抑制样品组分的解离 增加它在固定相中的溶解度 以达到分离有机弱酸 弱碱的目的 这种技术称为离子抑制色谱法 适用范围 适用于3 0 pKa 7 0弱酸 7 0 pKa 8 0弱碱 抑制剂 流动相中加入少量的弱酸 弱碱或缓冲溶液为抑制剂 常用乙酸 氨水 磷酸盐 乙酸盐 离子抑制色谱法 影响容量因子的因素 对于弱酸 当流动相pH pKa时 组分以分子形式为主 k值增大 tR增大 反之 组分以离子形式为主 k值变小 tR减小 对于弱碱 以上两种情况正好相反 用途 可用于有机弱酸 弱碱与两性化合物的分离 以及它们与分子型化合物共存时的分离 不适用于pKa 3的酸 pKa 8的碱 这些可采用离子对色谱法 离子交换色谱法进行分离 其他色谱法 阅读 离子色谱法手性色谱法环糊精色谱法胶束色谱法亲和色谱 一 根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品 其挥发性好 适用于气相色谱 标准液相色谱类型 液 固 液 液 及离子交换色谱 最适合的相对分子质量范围是200 2000 对于相对分子质量大于2000的样品 则用尺寸排阻法为最佳 第3节各类高效液相色谱法 弄清样品在水 异辛烷 异丙醇 苯 四氯化碳中的溶解度是很有用的 如果样品可溶于水并能离解物质 以采用离子交换色谱为佳 亲水性的 如样品可溶于烃类 如苯或异辛烷 则可采用液 固吸附色谱 亲脂性的 如果样品溶解于四氯化碳 则多采用常规的分配和吸附色谱分离 如果样品既溶于水又溶于异丙醇时 常用水和异丙醇的混合液作液 液分配色谱的流动相 以憎水性化合物作固定相 二 根据溶解度选择 用红外光谱法 可预先简单地判断样品中存在什么官能团 然后 确定采用什么方法合适 例如 酸 碱化合物用离子交换色谱 脂肪族或芳香族用液 液分配色谱 液 固吸附色谱 异构体用液 固吸附色谱 同系物不同官能团及强氢键的用液 液分配色谱 三 根据分子结构选择 液相色谱分离类型选择参考表 第4节固定相 一 液 固色谱固定相二 化学键合相三 其他固定相 1 硅胶 无定形多孔硅胶 国产代号YWG dp5 10 m 球形全多孔硅胶 国产代号YQG dp3 10 m 堆积硅珠 国产代号YQG dp3 5 m2 氧化铝 球形 5 10 m 无定形 5 10 m 3 高分子微孔多球 有机胶 国产YSG系列 日立3010胶等 4 其它 分子筛 聚酰胺等 一 液 固色谱固定相 用化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体 硅胶 表面上 所形成的固定相 称为化学键合相 具有分配和吸附作用 优点 使用过程不易流失 化学性质稳定 在pH2 8的溶液不变质 热稳定性好 一般在70 以下稳定 载样量大 比硅胶高约一个数量级 适于作梯度洗脱 二 化学键合相 化学键合相一般用硅胶作载体 具有分配作用和一定的吸附作用 吸附作用的大小视键合覆盖率而定 用化学反应方法将载体表面上残存的硅醇基除去 称为封尾 封顶或遮盖 所形成的键合相称为封尾键合相 完全封尾的键合相无吸附作用 缺点是疏水强 按极性分类 非极性 中等极性 极性键合相3类 非极性键合相 十八烷基硅烷键合相 ODS 是最常用的非极性键合相 中等极性键合相 常见的有醚基键合相 极性键合相 强极性 氨基键合相 分析糖类 中强极性 氰基键合相 三 其他固定相 1 离子交换剂2 凝胶3 手性固定相4 亲合色谱固定相 第5节流动相 溶剂系统 一 分离方程式二 Snyder溶剂分类三 正相洗脱与反相洗脱四 洗脱方式五 流动相溶剂的选择 一 分离方程式 依据分离方程式讨论溶剂系统对分离度的影响 分离度受三项因素左右 a项由色谱柱的质量决定 b c两项由流动相决定 分配系数比 与容量因子k虽然相互关联 但溶剂的种类主要改变 这是因为溶剂的种类不同 分子间的作用力的性质 强度不同 选择性不同 在溶剂种类确定以后 配比的调整只是改变极性 改变洗脱能力 改变保留时间 而分子间作用力的性质不变 因此主要是改变容量因子k 概括为 溶剂种类主要影响分配系数比 主要改变峰间距 溶剂配比主要影响容量因子k 主要改变保留时间 组分的分配系数 由样品组分 溶剂 固定相三者间的作用力 分子间作用力 综合作用所决定 表10 2 Snyder选用了乙醇 二氧六环 硝基甲苯3个参考物 用于检验3种分子间作用力 分别用Xe Xd Xn表述 测定 计算出溶剂的极性参数P 值列于表10 3 P 值大者 极性大 洗脱能力大 二 Snyder溶剂分类 正相洗脱 用极性小于固定相的流动相的洗脱方式 称为正相洗脱 正相展开 适用于正相色谱法 常用溶剂的极性参数P 与分子间作用力 P 大 极性大 洗脱能力强 例如 水 正己烷 正戊烷的值分别为10 2 0 1 0 0 作正相洗脱时 水洗脱能力最强 正己烷和正戊烷的洗脱能力最弱 三 正相洗脱与反相洗脱 反相洗脱 在反相洗脱中 溶剂的洗脱能力用强度因子S值表示 S值大者洗脱能力大 反相色谱的首选纯溶剂为甲醇 乙腈与四氢呋喃 常以水为底剂 无论正相或反相洗脱 一般均采用多元溶剂系统 1 等度洗脱 isocraticelution 用恒定配比的溶剂系统的洗脱方式 称为等度洗脱优点 简便 重复性好 色谱柱易再生 缺点 对于成分复杂的样品 效果欠佳 2 梯度洗脱 gradientelution 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值 离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 四 洗脱方式 梯度洗脱的实质 是通过不断地变化流动相的浓度配比 来调整混合样品中各组分的K值 使所有谱带都以最佳平均K值通过色谱柱 比较梯度洗脱与程序升温 在梯度洗脱中溶质K值的变化是通过溶剂的极性 pH值和离子强度来实现的 用于分离组分性质差别较大的复杂样品 而程序升温是借改变温度来影响溶质的K值 用于分离宽沸程的混合样品 优点 缩短分析周期 提高分离效果 改善峰形 很少拖尾 增加检测灵敏度 高效液相色谱中流动相是液体 它对组分有亲和力 并参与固定相对组分的竞争 流动相溶剂的选择将直接影响组分的分离度 基本要求 溶剂必须具有合适的极性和良好的选择性 相对于待测样品 参阅Snyder溶剂分类 溶剂要与检测器匹配 对于紫外吸收检测器 应注意选用检测波长比溶剂的紫外截止波长要长 五 流动相溶剂的选择 高纯度 由于高效液相灵敏度高 对流动相溶剂的纯度也要求高 不纯的溶剂会引起基线不稳 或产生 伪峰 痕量杂质的存在 将使截止波长值增加50 100nm 化学稳定性好 不与样品发生反应或聚合的溶剂 低粘度 若使用高粘度溶剂 势必增高压力 不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮 乙醇 乙晴等 但粘度过于低的溶剂也不宜采用 例戊烷 乙醚等 它们易在色谱柱或检测器内形成气泡 影响分离 五 流动相溶剂的选择 流动相溶剂一般原则 首选溶剂 多元系统的组成 洗脱能力 溶剂系统对样品的洗脱能力 替代溶剂系统 离子抑制色谱法 简要步骤 以正相色谱法为例 配制初试二元溶剂系统 调整溶剂系统的洗脱能力 按初始系统的S值 配制相同S值的替代溶剂系统 若二元溶剂系统效果不好 可增加元数或加极性调整剂 对组分性质差别较大的样品 等度洗脱无法兼顾两头 可用梯度洗脱 五 流动相溶剂的选择 第6节高效液相色谱仪 一 仪器组成概述二 高压输液系统三 进样系统四 分离系统 色谱柱五 检测系统 高效液相色谱仪由五大部分组成 高压输液系统进样系统 分离系统 检测系统和色谱工作站 一 仪器组成概述 高效液相色谱分析过程 分析前 选择适当的色谱柱和流动相 开泵 冲洗柱子 待柱子达到平衡而且基线平直后 用微量注射器把样品注入进样口 流动相把试样带入色谱柱进行分离 分离后的组分依次流入检测器的流通池 最后和洗脱液一起排入流出物收集器 当有样品组分流过流通池时 检测器把组分浓度转变成电信号 经过放大输入计算机 经过工作站数据处理 就得到色谱图 色谱图是定性 定量和评价柱效高低的依据 二 高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细 因此对流动相阻力很大 为使流动相较快流动 必须配备有高压输液系统 高压输液系统由储液罐 高压输液泵 过滤器 梯度洗脱装置等组成 1 储液罐一般由玻璃 不锈钢或氟塑料制成 容量为1 2L 用来储存足够数量 符合要求的流动相 注意 流动相在进入高压泵之前 应先进行脱气和过滤处理 2 输液泵有恒流泵和恒压泵两种 高压输液泵是核心部件 要求 密封性好 输出流量恒定 压力平稳 可调范围宽 便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求 恒流泵特点输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关 分为机械注射泵和机械往复泵 常用 两种 恒压泵特点能保持输出压力恒定 但其流量则随色谱系统阻力而变化 故保留时间的重视性差 二 高压输液系统 柱塞往复泵示意图 柱塞往复泵的两种连接方式 3 梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值或离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 梯度洗脱装置分为两类 外梯度装置 又称低压梯度 流动相在常温常压下混合 用高压泵压至柱系统 仅需一台泵即可 内梯度装置 又称高压梯度 将两种溶剂分别用泵增压后 按电器部件设置的程序注入梯度混合室混合 三 进样系统 进样系统是将被分离的样品导入色谱柱的装置 一般包括进样口 注射器和进样阀等 要求密封性 重复性好 死体积小 便于实现自动化 1 注射器微量注射器 5 L 10 L等 2 进样阀六通阀进样器 如下图所示 进样系统是引起柱前展宽的主要因素 四 分离系统 色谱柱 色谱柱是系统的心脏部件 包括柱管与固定相两部分 柱管材料有玻璃 不锈钢 铝 铜及内衬聚合材料的其他金属 玻璃管耐压有限 故金属管用得较多 柱长 内径分析型柱长10 25cm 内径为2 5mm 实验制备型柱长10 30cm 内径20 40mm 前置柱 预柱 一般在分析柱前端 其内填充物和分析柱完全一样 淋洗溶剂由于先经过前置柱而被其中的固定相饱和 它流过分析柱时就不再洗脱其中固定相 保证分离性能不受影响 装柱方法一般采用匀浆填充法装柱 先将固定相填料调成匀浆然后在高压泵作用下 快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内 经冲洗后 即可备用 柱的再生有反相洗脱再生和正相洗脱再生两种 色谱柱的柱效评价 按规定 用HPLC建立分析方法时 需进行 系统适用性试验 给出分析状态下最小理论板数 分离度 重复性和拖尾因子 对称因子 分析样品时 需检验柱性能是否合乎要求 可见评价柱效的重要意义 评价的推荐条件 流动相流量1mL min 进样量10 L 检定波长254nm 其它参见下表 色谱柱的柱效评价 检测器是反映色谱过程中组分浓度随时间变化的重要部件 要求灵敏度高 重复性好 线性范围宽 死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 有两种类型 溶质性检测器它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应 此类检测器有紫外 荧光 电化学检测器等 总体检测器它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应 此类检测器有示差折光检测器 已少用 等 1 紫外 可见光检测器 UV Vis 2 荧光检测器3 激发光散射检测器4 化学发光检测器5 安培检测器 五 检测系统 检测原理 基于Lambert Beer定律 即被测组分对紫外光或可见光具有吸收 且吸收强度与组分浓度成正比 液相色谱仪一般都配置有UV Vis检测器 组成 光源 流通池 检测元件 工作站等 特点 灵敏度高 噪声低 不破坏样品 可用于制备 对温度 流动相流速波动不敏感 可用于梯度淋洗 属于浓度型检测器 缺点 只能检测有紫外吸收的样品 检测波长 流动相的截止波长 波长选择 选择 max作检测波长 以得到较高的灵敏度 检测波长 流动相的截止波长 紫外检测器的类型 固定波长型 已淘汰 可变波长型 最常用 二极管阵列检测器 最新型 1 紫外 可见光检测器 二极管阵列检测器 di