菌落总数、大肠菌群测定方法

菌落总数和大肠菌群测定 固体样品 菌落总数和大肠菌群测定 固体样品 药药 品 品 1 平板计数琼脂 2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 LST 3 煌绿乳糖胆盐肉汤 BGLB 4 氯化钠 设备材料 设备材料 烧杯 三角瓶 广口瓶 培养皿 刻度吸管 倒气管 玻璃 棒 试管 硅胶塞 洗耳球 棉花 布或报纸等 一 一 准备工作准备工作 指导书是按一个样品所需物品准备的 实验室可按样品量增加 1 平板计数琼脂培养基准备 用于菌落总数测定 将三角瓶三角瓶放在电子称上 去皮 按平板计数琼脂使用说明称量 加 200ml 蒸馏水蒸馏水搅拌 放电炉上煮沸加热煮沸 充分溶解 盖上硅胶塞 用报纸或布包好 再用橡皮筋扎紧 2 月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 肉汤 用于大肠菌群测定 a 将烧杯烧杯放在电子称上 去皮 按使用说明称量 加 100ml 蒸蒸 馏水馏水搅拌 放电炉上煮沸 充分溶解 b 用 10ml 毫升 毫升 的吸管分装到 9 支 18 180 规格 试管中 每 支试管加 10ml 的月桂基溶液 LST 合计 90 毫升 c 9 支试管分别放入倒气管倒气管 开口向下 排气 盖上硅胶塞 3 0 85 的生理盐水 用于样品稀释 将广口瓶广口瓶去皮 称取氯化钠氯化钠 1 91g 加 225ml 蒸馏水 摇匀 用报 纸或布包好 再用橡皮筋扎紧 同样配制第二瓶 4 准备 2 个空试管 盖上硅胶塞 用于样品稀释 5 准备 8 个培养皿 用布包扎好 6 准备至少 3 支 5ml 和 1 支 10ml 带有刻度的吸管 用布包扎好 顶 部可用棉球塞住 防止吸液时 液体不慎吸入洗耳球 7 准备操作的工具 剪刀 1 把 镊子 1 个 勺子等打开产品包装所需 工具 用布包扎好 二 使用灭菌锅灭菌二 使用灭菌锅灭菌 1 检查灭菌锅底部加热管水位是否正常 水位要高过加热丝 2 将上面准备好的 7 步骤物品逐一放入锅内 注意 滴定管吸口 向下 有棉球的向上 3 盖上灭菌锅盖子时 将排气管插到排气口内 注意从对角线开 始拧紧螺丝 将排气阀打开 安全阀始终关闭 通电后 待排气阀放 气 3 分钟后 锅内冷空气已经排完 关闭排气阀 4 查看灭菌锅的压力表 当温度升到 121 压力升到 0 1MP 兆 帕 时 灭菌维持 15 分钟后 温度和压力不能过高或者过低 断电自然 冷却到接近 0 度后 慢慢打开排气阀 再对角拧开灭菌锅 三 无菌操作三 无菌操作 进无菌室前的准备 放好工具 酒精灯 记号笔 消毒用 75 酒 精棉球 洗耳球 电子称 打开紫外线杀菌灯 杀菌 30 分钟后关闭 再等 10 分钟后进入无菌室 无菌室缓冲间应放有 白色衣服 帽子 鞋子和口罩等 1 待灭菌锅自然冷却后 取出 6 件灭菌好的物品 留下平板计数 琼脂培养基 PCA 在灭菌锅里待用 该液体凉后会凝固 应保持温度 50 左右 2 用 75 的酒精棉球消毒手和操作台面 3 点着酒精灯 准备接种 接种过程在酒精灯周围 10cm 范围进 行 4 无菌操作 A 拿出第一瓶生理盐水 用 10 毫升的吸管分别吸 9ml 生理盐 水加入 2 个空的试管中 再吸 1ml 的生理盐水 放入 1 个培养皿内 这是生理盐水空白试验用的 这是生理盐水空白试验用的 10ml 吸管使用 3 次 不再使用 B 准备制样 用 75 的酒精棉球擦拭样品包装准备开口处 拿 出第二瓶生理盐水 放在电子称上 去皮 称取或量取 25g mL 样 品 放入 225ml 生理盐水中充分摇匀 制成稀释制成稀释 10 倍的检测样品 即倍的检测样品 即 10 1溶液 溶液 注意摇匀 见书中最后 见书中最后 1 页图 页图 C 取出第一个 5ml 的吸管 吸取 5ml 的 检测样品 10 1溶液 分别放入 2 个培养皿和 3 个试管中 各放 1ml 再吸取 1ml 检测样品 10 1溶液 放入 9ml 生理盐水的试管中 制成稀释制成稀释 100 倍的检测样品 倍的检测样品 即即 10 2溶液 溶液 注意摇匀 D 取出第二个 5ml 的吸管 吸取 5ml 的 检测样品 10 2溶液 分别放入 2 个培养皿和 3 个试管中 各放 1ml 再吸取 1ml 放入 9ml 生理盐水的试管中 形成稀释形成稀释 1000 倍的检测样品 即倍的检测样品 即 10 3溶液 溶液 注 意摇匀 E 取出第三个 5ml 的吸管 吸取 5ml 的 检测样品 10 3溶液 分别放入 2 个培养皿和 3 个试管中 各放 1ml 注意摇匀 详见书 中最后 1 页图 F 取出灭菌锅内的三角瓶 平板计数琼脂培养基 PCA 用手感 觉瓶子热度 以 45 50 度为宜 过热或过低均不行 分别倒入 8 个培 养皿内 15 20ml 平板计数培养基 注意倒入时仅拿开一点点盖子 并 在酒精灯边上操作 左右摇匀 待平板计数培养基凝固后 倒置培养 皿 其中有其中有 1 个培养皿是用于做个培养皿是用于做平板计数培养基空白试验的 空白试验的 四 培养四 培养 要求培养箱温度在 36 1 度 培养时间在 48 2 小时 将 8 个培养皿 倒置 和 9 个试管均放入培养箱内进行培养 五 检查结果 计算五 检查结果 计算 1 计算大肠菌群 计算大肠菌群 培养 24h 取出 9 个试管 观察是否有产酸产气现象 浑浊即为产 酸 倒气管悬空即为产气 有几个试管产酸产气 即准备做几个煌绿 乳糖胆盐肉汤试管 煌绿和月桂基硫酸盐胰蛋白胨 LST 肉汤 做法同 样 即 看药品使用说进行配制 称量称量 煮沸溶解煮沸溶解 分装分装 加入倒气管加入倒气管 排气排气 塞硅胶塞塞硅胶塞 灭菌备用 灭菌备用 1 类结果 均无产酸产气现象 继续培养 24h 检验值是 30MPN 100g 2 类结果 煌绿试管有产酸产气现象 查看各稀释度产酸产气个数 对照书中 倒数第 2 页 表格 找出结果后乘以 100 再保留 2 位有效 数字 例如 4 3 102 2 计算菌落总数 计算菌落总数 取出 8 个培养皿 逐一观察 不论菌落大小 连在一起的计算为 1 个 如果菌落比较多 可以分成 4 个区来计数 1 类结果 空白试验的 2 个培养皿