酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

精品文档 1欢迎下载 酵母菌储存在 酵母菌储存在 70 70 中 引物和质粒中 引物和质粒 DNADNA 储存在储存在 20 20 中 中 概念 概念 1 1 次序转化次序转化 指的是先将一种质粒转化进酵母中 常是 DNA BD bait plasmid 在选择培 养基中选择出阳性克隆 之后再将另外一个质粒 AD fusion library 转化进去 优点 就是比共转化使用更少的质粒 DNA 也就是节约质粒 DNA 2 2 共同转化共同转化 将两种质粒一起转化进酵母中 优点 比次序转化更容易操作 pGBKT7 pGBKT7 的选择物是 的选择物是 kanamycinkanamycin 卡那霉素 卡那霉素 pGADT7 pGADT7 的选择物是 的选择物是 ampicillinampicillin 氨苄西林氨苄西林 各种各种 SDSD 培养基 培养基 1 1 SD adeSD ade 腺嘌呤 腺嘌呤 leu leu 亮氨酸 亮氨酸 trp trp 色氨酸 色氨酸 his his 组氨酸 组氨酸 1000 1000 ml ml 四缺四缺 酵母氮源 YNBYNB 6 7g ade leu trp his DO supplement 0 60g 购买来就配好的 葡萄糖 20g 即 2 2 2 SD leu trp hisSD leu trp his 1000 1000 ml ml 酵母氮源 YNBYNB 6 7g leu trp his DO supplement 0 62g 购买来就配好的 葡萄糖 20g 即 2 3 3 SD leu trpSD leu trp 1000 1000 ml ml 二缺二缺 酵母氮源 YNBYNB 6 7g ade leu trp his DO supplement 0 64g 购买来就配好的 葡萄糖 20g 即 2 4 4 SD leuSD leu 1000 1000 ml ml 酵母氮源 YNBYNB 6 7g leu DO supplement 0 69g 购买来就配好的 葡萄糖 20g 即 2 5 5 SD trpSD trp 1000 1000 ml ml 酵母氮源 YNBYNB 6 7g ade leu trp his DO supplement 0 74g 购买来就配好的 葡萄糖 20g 即 2 注意 YNB 有两种 一种含有硫酸胺 另外一种不含硫酸胺 我们这用的是含硫酸铵的 我们这用的是含硫酸铵的 买来就加进去了的 买来就加进去了的 如果不含硫酸铵 那么要在终浓度 0 17 的 YNB 中再加入 0 5 的硫 酸铵 即最终在 1000 ml 溶液中加入总量为 6 7g 的 YNB 与硫酸铵 精品文档 2欢迎下载 实际配制的方法是 实际配制的方法是 1 配制 40 的葡萄糖贮存液 贮存在 贮存在 4 4 过滤除菌 待高压灭菌的溶液温度降至 55 以下时 再将 50ml 葡萄糖贮存液加入 过滤即可使用 过滤即可使用 2 2 酵母氮源 6 7g 加 DO supplement 在 920ml 水中溶解 调 PH 至 5 8 大约加 大约加 10M10M NaOHNaOH 200ul200ul 即可 即可 之后补水至 950 ml 3 高压完后待温度降至 55 以下 加入 50 ml40 葡萄糖 YPDYPD 培养基培养基 1000 1000 ml ml 20 g L 蛋白胨 10 g L 酵母提取物 20 g L 琼脂 只有制作平板才用 20 g L 葡萄糖 即 2 1x1x YPDAYPDA 培养基培养基 1000 1000 ml ml 20 g L 蛋白胨 10 g L 酵母提取物 0 03 g L 腺嘌呤 即终浓度为 0 003 腺嘌呤可以耐受高温 20 g L 葡萄糖 即 2 实际配制的方法是 实际配制的方法是 1 配制 40 的葡萄糖贮存液 贮存在 贮存在 4 4 过滤除菌 待高压灭菌的溶液温度降至 55 以下时 再将 50ml 葡萄糖贮存液加入 李博士经验这一步不高压 过滤即可使用 李博士经验这一步不高压 过滤即可使用 2 配制 0 2 的腺嘌呤溶液 过滤除菌 待高压灭菌的溶液温度降至 55 以下时 再将 15ml 腺嘌呤溶液加入 或将腺嘌呤直接加进去 为了方便我将直接加进去一起高压 3 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 水大约 925ml 混合后 调至 PH 至 6 5 加水至 935ml 121 高压 15min 注意 高压的温度和时间不能太长与太高 121 高压 15min 即可 可以在 YPDA 中加入 20 g L 的琼脂 以配成平板 需要加 kanamycin 时 kan 终浓度是 10 15 mg L kanamycin 可以 20 贮存一个月 加入到平板中去可以 4 贮存一个月 PEG LiAcPEG LiAc 溶液 即配即用 溶液 即配即用 用下列贮存液来配制 50 PEG 3350 用灭菌水配 如需要可以加热至 50 以助溶 10X TE buffer 用灭菌水配 如需要可以加热至 50 以助溶 10X LiAc 用灭菌水配 如需要可以加热至 50 以助溶 最后配成最后配成 PEG LiAcPEG LiAc 溶液是 以溶液是 以 10ml10ml 为例 为例 终浓度 为配制 10mlPEG LiAc 需要加入的物质 PEG 4000 40 8 ml of 50 PEG TE buffer 1X 1 ml of 10X TE 精品文档 3欢迎下载 LiAc 1X 1 ml of 10X LiAc 无菌无菌 1x1x TE LiAcTE LiAc 溶液 用溶液 用 10 x10 x 已灭菌的贮存液稀释 已灭菌的贮存液稀释 10 x TE buffer 0 1 M Tris HCl 10 mM EDTA pH 7 5 高压 10 x LiAc 1 M 用稀醋酸调节 PH 至 7 5 高压 ForFor galactosidase galactosidase 滤膜实验滤膜实验 Z Z bufferbuffer 溶液 溶液 Na2HPO4 7H2O 16 1 g L 如换 Na2HPO4 14H2O 则 20 739 g L NaH2PO4 H2O 5 50 g L 如换 NaH2PO4 2H2O 则 6 21g L KCl 0 75 g L MgSO4 7H2O 0 246 g L 最后调最后调 PHPH 至至 7 07 0 高压 室温下可以贮存 高压 室温下可以贮存 1 1 年年 X galX gal 溶液 溶液 X GAL 溶解于 DMF 二甲基甲酰胺 中至浓度为 20 mg ml 20 C 避光保存 Z Z buffer X galbuffer X gal 溶液 溶液 100 ml Z buffer 0 27 ml mercaptoethanol 巯基乙醇 1 67 ml X gal 贮存液 ONPGONPG 溶液 即配即用 溶液 即配即用 ONPG 溶于 Z buffer 中 终浓度 4 mg ml 调 PH 至 7 0 注意 注意 1 ONPG 需要 1 2h 才能溶解 2 每次用之前新鲜制备 带有带有 巯基乙醇的巯基乙醇的 Z Z bufferbuffer 将 0 27 ml 巯基乙醇加入 100 ml Z buffer 中即可 为了转化成功的小提示 为了转化成功的小提示 1 用一个 1 3 周龄 直径 2 3mm 的菌落去接种液体培养基 如果菌落直径 2mm 就用多几个菌落去接种 也要大力涡旋使细胞团分散开来 2 如果过夜或者 3hr 之后的培养基明显成块 那么在使用之前一定要充分涡旋使培养 基 3 当通过离心收集细胞的时候 使用一个离心管即可 可以更好 更充分地收集细胞 精品文档 4欢迎下载 4 为了提高转化效率 要在 1 小时内准备酵母感受态细胞 如果有必要 可以在 11 步 之后在室温条件下储存酵母感受态细胞几个小时 而活性却只有一点降低 5 当进行通同转化的时候 诱饵 诱饵 BDBD 质粒的量必须过度 而 质粒的量必须过度 而 ADAD 质粒的量要不足 质粒的量要不足 一 般 BD 是 AD 的两倍 李博士 此要求一般是针对文库筛选而言 6 为了使菌落更好地生长 在涂布转化复合物到琼脂平板上时要直到所有液体被吸收 可以选择直径 5mm 的无菌玻璃珠 每一个 100mm 的平板用 5 7 个玻璃珠 直径 150mm 的平 板用 7 9 个玻璃珠 去促进转化复合物的扩散 摇动的时候 shake the plate back and forth not round and round 科内似并无此操作 而仅仅以玻棒涂布耳 一 复苏酵母 复苏酵母 将酵母细胞接种到 YPD 固体培养基中培养 培养 1 3 周 接种的时 候采取四区分区画线法 二二 酵母感受态细胞置备和转化步骤 酵母感受态细胞置备和转化步骤 1 取直径 2 3mm 的克隆接种到 1ml 的 YPD 或 SD 培养基中 2 剧烈振荡或涡旋 5min 使所有团块分散开来 3 转移酵母液到 50 mlYPD 固体 也有液态的 未加入琼脂粉耳 或者 SD 培养基中 4 置于 30 摇床中 以 250 rpm 的转速震荡培养基 16 18h 直到 OD600 1 5 5 转移部分过夜培养物 30ml 到 300mlYPD 培养基 固体 中 使最终 OD600 在 0 2 0 3 之间 6 30 摇床以 230 rpm 的转速震荡培养基 3 4h 直至 OD 为 0 4 0 6 If the OD600 is 0 4 something is wrong with the culture 7 转移酵母液至 50ml 离心管中 1000g 室温 20 21 C 离心 5min 8 弃去上清 加入 25 50ml 无菌水或无菌的 1x TE 重悬酵母 9 在 1000g 室温 20 21 C 条件下离心 5min 10 轻轻倒出 弃去 上清 11 将细胞重悬于 1 5ml 新鲜准备的 无菌的新鲜准备的 无菌的 1xTE 1xLiAc1xTE 1xLiAc 在实验开始之前置备 在实验开始之前置备 至此酵母感受态细胞制备完毕至此酵母感受态细胞制备完毕 12 向无菌的 1 5ml 微量离心管中加入质粒 DNA 各 0 1ug 和 0 1mg 鲱鱼精载体 DNA 之后 轻轻混匀 13 再向每管中加入 0 1 ml 酵母感受态细胞 并且震荡混匀 14 向每一管加入 600 ul 无菌 PEG LiAc 溶液 高速振荡混匀 15 30 摇床以 200 rpm 的转速振荡培养 30 min 16 向每一管加入 70 ul DMSO 轻轻颠倒混匀 不要震荡 17 42 水浴热激 15 min 18 取出后在冰上冷却 1 2 min 19 1000 rpm 室温离心 5 min 弃去上清 20 用 0 5 ml 无菌的 1 TE 重悬酵母 21 取合适体积的菌液 一般是 100 ul 涂在选择性的 SD 培养基的平板上 在 30 培养箱 中培养 2 4 天 将克隆分成三份涂与不同平板上 1 3 涂在 SD His Leu Trp 1 3 涂 精品文档 5欢迎下载 在 SD Ade His Leu Trp 最后 1 3 涂在 SD Leu Trp 上 科内仅涂布二缺与四 缺板 在 在 2121 步之后涂一个二缺板和一个四缺板 因为在二缺板中步之后涂一个二缺板和一个四缺板 因为在二缺板中 AH109AH109 能生长 说明能生长 说明 BDBD 和和 ADAD 已经转进去了 如果在四缺板中能生长 说明诱饵和文库肯定有作用 接着做一个已经转进去了 如果在四缺板中能生长 说明诱饵和文库肯定有作用 接着做一个 galgal 实验 如果是将质粒转到实验 如果是将质粒转到 Y187Y187 中的话 中的话 2121 步之后涂一个二缺板就行了 如果酵母能生步之后涂一个二缺板就行了 如果酵母能生 长的话就接着做一个长的话就接着做一个 galgal 所以有的人同时转化两种菌种 这样就完全可以确定两蛋 所以有的人同时转化两种菌种 这样就完全可以确定两蛋 白是否有作用了 白是否有作用了 之后计算转化率 如果转化率达到 10 的 6 次方以上 那么就可以接着做后面的检验实验 三三 和和 gal gal 实验 实验 我就做 gal 试验 要注意如果做 gal 的 话 这时候菌种要换成 Y187 而不是之前的 AH109 在 在 protocolprotocol 的的 2424 2828 页 页 1 试剂 2 原理 ONPG 为无色物质 在 半乳糖苷酶的作用催化下生成黄色的 onitrophenol 硝基苯 酚 在 420 nm OD410 处有光吸收 Na2CO3可以提高 PH 值 使酶变性 从而终止反应 Na2CO3在配制时 不需要高压 3 实验方法 一一 Colony liftColony lift FilterFilter AssayAssay 滤膜分析或滤膜试验 滤膜分析或滤膜试验 这是 这是定性试验定性试验 a 将要测试的菌株 直径 1 3mm 转接到新的选择性 SD 培养基中 30 培养 2 4 天 b 准备 Z buffer X gal 溶液 c 为每一个要测试的平板准备好一张无菌的 Whatman 滤纸 置于 100mm 或 150mm 无菌平 板中用 2 5 5ml Z buffer X gal 溶液浸泡 d 用无菌的镊子小心地将无菌 Whatman 滤纸覆盖到平板表面 要使所有的待测菌株都有 部分沾到滤纸上 e 用注射器在滤纸上打 3 个或更多的不对称的孔 以标志方向 f 滤纸放入液氮中 0 5 1min 至结冰 之后再放置于室温融化 如此反复冻融 3 次 g 小心地将带有菌株的滤纸放到预浸泡的滤纸上 有菌株一面向上 注意两层滤纸中间 不要有气泡 h 平板放到 30 培养箱中 观察其是否变蓝 一般阳性克隆在 0 5 8h 内会变蓝 超过 8h 容易产生假阳性结果 二二 LiquidLiquid CultureCulture AssayAssay 以 以 ONPGONPG 为底物的为底物的液体培养法液体培养法 这是 这是定量试验定量试验 1 在合适的 SD 培养基中制备 5 ml 过度培养物 注意 注意 你所选用的 SD 培养基要适合你所用的系统和质粒 2 在进行实验当天 将 ONPG 以 4 mg ml 的浓度溶于 Z buffer 中 振荡 1 2h 确保完全 溶解 3 大力涡旋过夜培养基 1min 以分散细胞团块 立即转移 2ml 0 5ml 过夜培养基物到 8ml 2ml YPD 培溶液中 以 25 的含量加 精品文档 6欢迎下载 4 30 培养 3 5h 230 250 rpm 直至细胞进入对数生长期 1ml 溶液的 OD600应在 0 5 0 8 之间 在收获细胞的同时记录 OD600值 注意 注意 在检测 OD 值的时候 涡旋培养基 0 5 1ml 以分散细胞团块 5 各吸取 1 5 ml 0 5 ml 培养物到各 3 个 1 5 ml 离心管 每个管子就是 1 5ml 离 心 14000 rpm 30sec 6 小心移去上清 加上 1 5 ml 0 5 ml Z buffer 到每个管中 涡旋直到细胞重悬 7 再次离心并移去上清 加上 300ul 100 ul Z buffer 到每个管中 涡旋直到细胞重 悬 这样 终浓度就是 1 5 0 3 5 倍 注意 在这个清洗步骤之后 细胞收获物的差异可以通过再次读取 OD600值来纠正 8 转移 0 1ml 细胞悬液至新的离心管中 9 将细胞置于液氮中 约 0 5 1min 直至细胞冰冻 10 将离心管放于 37 水浴中 0 5 1min 使其融化 11 反复冻融 3 次 重复 9 和 10 步 确保细胞裂解 12 用 100 ul Z buffer 来设置一个空白对照 13 加 0 7 ml 的 Z buffer 与 巯基乙醇到反应管和空白管中 注意 在冰冻之前不要加注意