iCelligence 基本实验方案

i iCELLigenceCELLigence 基本实验方案基本实验方案 艾森生物艾森生物 2 iCELLigenceiCELLigence 系统的核心技术原理及基本应用概况系统的核心技术原理及基本应用概况 细胞生物学是通过研究细胞的结构与功能阐明其生命活动基本规律的科学 细胞生物学的主要研 究内容包括基因 信号传导 细胞生长 分化和发育的分子机制及其遗传控制 细胞识别及免疫及分 子细胞生物学 目前大部分细胞学研究的检测形式多是终点检测法 仅仅给实验提供了一个最终结果 而且经常 需要标记和破坏细胞 但因为细胞是活体 生物和细胞进程是动态而非静态的 终点检测法大大局限 了生物信息的全程动态收集 iCELLigence 系统的开发和应用解决了传统细胞检测的局限性 iCELLigence 的核心技术是基于非标记 动态实时细胞分析检测 该技术采用微机械加工技术 在细胞 培养板的每个细胞生长孔的底上设计了金微电极阵列 用以构建能实时 连续 定量跟踪细胞形态和 增殖分化改变的细胞阻抗测试传感器 贴壁生长在微电极表面的细胞可引起贴壁电极界面阻抗的改变 从而可以获得细胞生理功能相关的生物信息 iCELLigenceiCELLigence 系统的检测优势包括 系统的检测优势包括 高信息量 可连续检测生物反应的全过程 提供大量重要的动态反应信息 无标记 分析无需昂贵的标记或报告 无创伤 电子检测不会干扰细胞生长和分析 高准确度和精确度 定量衡量细胞生长 提供高于 2 个数量级的动态范围 孔对孔 CV 通常低于 10 自动实时检测 整个实验过程自动收集数据 实时分析 大大改善仅仅在最终点分析的结果 灵活性 独特的设计允许自定义分析项目 提高实验室的效率 易操作 用户友好的软件 简单直接的安装 简化培训和操作 活细胞品质控制 在培养孔中检测细胞质量 基于 iCELLigence 系统的检测优势 目前开发的一系列应用包括 细胞质量控制 细胞增殖 化 合物 细胞和病毒介导的细胞毒性 细胞粘附和扩展 细胞迁移和浸润 IgE 介导的肥大细胞致敏活 化及脱颗粒 受体介导的信号通路传导 GPCR RTK NK 细胞介导的杀伤肿瘤细胞 病毒 CPE 及中和 实验的监测 细菌毒素介导的细胞病变的监测 心脏细胞功能和毒性监测等等 该技术已经在细胞研 究中广泛应用 近年的已经在 SCI 收录的杂志上发表的文献已达 200 多篇 3 实验方案实验方案 实验 1 细胞增殖实验 实验 2 化合物介导的细胞毒性检测 实验 3 细胞黏附实验 实验 4 配体 受体相互作用介导的信号转导 4 实验实验1 1 细胞增殖实验细胞增殖实验 1 1 概述概述 细胞增殖是生物体的重要生命特征 细胞以分裂的方式进行增殖 单细胞生物 以细胞分裂 的方式产生新的个体 多细胞生物 以细胞分裂的方式产生新的细胞 用来补充体内衰老或死亡的细 胞 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法 只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在 观察细胞生长变化的实验中应用 因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中 生长曲线的测定 是最为基本的指标 传统方法测定细胞生长曲线一般利用细胞计数法进行 实验过程繁琐且耗时 见 附件 使用 iCelligence 实时细胞分析系统方便实时地动态监测细胞贴壁和增殖过程 2 2 实验目的实验目的 检测细胞的增殖曲线 在实验开始后观察细胞在 xCELLigence 系统上的增殖生长过程 并以该曲 线为基础 判断细胞的质量 3 3 实验材料实验材料 细胞株 A549 ATCC Cat No CCL 185 人非小细胞肺癌细胞 株 仪器设备 CO2 培养箱及其它细胞培养设备 iCELLigence 系统 E Plate L8细胞培养板 试剂 A549细胞培养基 F 12K Nutrient Mixture Gibco Cat No 211127 containing 10 Fetal Bovine Serum FBS Gibco Cat No 16000 044 1 Penicilline Streptomycin solution Gibco Cat No 15140 122 0 25 Trypsin EDTA solution Gibco Cat No 25300 054 Phosphate buffered saline PBS Hyclone Cat No SH30256 01B 4 4 实验操作流程实验操作流程 4 1 细胞悬液准备 细胞悬液准备 5 4 1 1 在超净工作台内 于无菌条件下 吸除培养皿内旧培养液 4 1 2 以 PBS 液清洗 1 2 次 于培养皿内加入 1mL T75 培养瓶 含 EDTA 的胰蛋白酶溶液 盖好盖 置 37 C 温箱中温育 2 6 min 后 在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况 若细胞质回缩 细胞间歇增 大 终止消化 4 1 3 轻轻吸除消化液 加入培养基 10mL 培养瓶 用移液管反复轻轻吹打贴壁的细胞 使它们形成细 胞悬液 将细胞悬液转移到 50mL 离心管中 1000 x rpm 离心 5 min 去除上清 加入新鲜培养基 并用移液管将细胞吹打均匀 用计数板计数细胞悬液浓度后 配制成实验细胞浓度为 2 105 ml 1 105 ml 0 5 105 ml 0 25 105 ml 4 24 2 使用使用 iCelligenceiCelligence 系统进行检测系统进行检测 4 2 1 在 E Plate L8 的孔中加入 150 l 培养基 4 2 2 将 E Plate L8 放到 iCelligence 系统上 系统会自动进行扫描 检查是否接触良好 若接触良 好则可进行下一步 4 2 3 点击主页上 New Experiment 进入 Protocol 页面 选择需要进行的实验类型 Cell QC 选择 Standard Protocol 确定实验流程 4 2 4 点击 Layout 页面 设置实验孔的细胞名称 数目 4 2 5 点击左下角开始的标志 开始检测基线 4 2 6 取出 E Plate L8 在孔中加入 300 l 混合均匀的 A549 细胞悬液 使每孔中细胞数目为 60 000 30 000 15 000 7 500 cells 4 2 7 将 E Plate L8 置于超净台中室温放置 30min 4 2 8 将 E Plate L8 放到培养箱中的 iCelligence 上 4 2 9 在系统自动扫描 Scan Plate 后 开始 Step2 检测细胞增殖曲线 5 5 典型结果及数据分析典型结果及数据分析 不同密度梯度 A549 细胞的增殖曲线 6 60k 30k 15k 7 5k Media 实验实验2 2 化合物介导的细胞毒性检测化合物介导的细胞毒性检测 1 1 概述概述 研究化合物介导的细胞毒性是新药发现与开发 例如 抗肿瘤药物的筛选 药物心脏毒性检 测 的重要领域 另外 新的药物 化妆品 食品添加剂等在投入使用之前 则必须进行大量的细胞毒 性试验来证明它们是无毒安全的 使用 iCELLigence 实时细胞分析系统评估化合物介导的细胞毒性 细胞会通过细胞和微电极之间的相互作用产生电信号 当加药以后 化合物作用于细胞导致细胞形态 粘附能力等状态发生综合的变化 这些实时的变化可以通过 RTCA 系统的监测用电信号的形式反映出来 如果该化合物最终导致细胞死亡 那么信号就会降低至零 反之 则对信号没有影响 2 2 实验目的实验目的 检测细胞的增殖曲线 在实验开始后观察细胞在 xCELLigence 系统上的增殖生长过程 并以 该曲线为基础选择合适的药物添加时间 添加药物后计算药物的 IC50 及获得药物浓度梯度依赖性反应 曲线 3 3 实验材料实验材料 细胞株 A549 ATCC Cat No CCL 185 人非小细胞肺癌细胞 株 仪器设备 CO2 培养箱及其它细胞培养设备 iCELLigence 系统 E Plate L8细胞培养板 试剂 A549细胞培养基 F 12K Nutrient Mixture Gibco Cat No 211127 containing 10 Fetal Bovine Serum FBS Gibco Cat No 16000 044 1 Penicilline Streptomycin solution Gibco Cat No 15140 122 0 05 Trypsin EDTA solution Gibco Cat No 25300 054 Phosphate buffered saline PBS Hyclone Cat No SH30256 01B 8 3 3 化合物信息化合物信息 Paclitaxel 抗肿瘤药 可促进微管双聚体装配成微管 使微管稳定 从而阻碍细胞分裂 抑制肿瘤 生长 化合物储存液配制 1 02mg Paclitaxel MW 853 9 g mol 溶于 1 ml DMSO 配制成 1 2 mM 储存液 并分装冻存 20 C 4 4 实验操作流程实验操作流程 第一天 4 1 细胞悬液准备 细胞悬液准备 4 1 1 在超净工作台内 于无菌条件下 吸除培养皿内旧培养液 4 1 2 以 PBS 液清洗 1 2 次 于培养皿内加入 1mL T75 培养瓶 含 EDTA 的胰蛋白酶溶液 盖好盖 置 37 C 温箱中温育 2 6 min 后 在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况 若细胞质回缩 细胞间歇增 大 终止消化 4 1 3 轻轻吸除消化液 加入培养基 10mL 培养瓶 用移液管反复轻轻吹打贴壁的细胞 使它们形成细 胞悬液 将细胞悬液转移到 50mL 离心管中 1000 x rpm 离心 5 min 去除上清 加入新鲜培养基 并用移液管将细胞吹打均匀 用计数板计数细胞悬液浓度后 配制成实验需要的细胞浓度 5 x 104 cells ml 4 24 2 使用使用 iCelligenceiCelligence 系统进行检测系统进行检测 4 2 1 在 E Plate L8 的孔中加入 150 l 培养基 4 2 2 将 E Plate L8 放到 iCelligence 系统上 系统会自动进行扫描 检查是否接触良好 若接触良 好则可进行下一步 4 2 3 点击主页上 New Experiment 进入 Protocol 页面 选择需要进行的实验类型 Cytotoxicity 选择 Standard Protocol 确定实验流程 4 2 4 点击 Layout 页面 设置实验孔的细胞名称 数目和药物的名称及浓度 4 2 5 点击左下角开始的标志 开始检测基线 4 2 6 取出 E Plate L8 在孔中加入 300 l 混合均匀的 A549 细胞悬液 使每孔中细胞数目为 15 000 cells 4 2 7 将 E Plate L8 置于超净台中室温放置 30min 4 2 8 将 E Plate L8 放到培养箱中的 iCelligence 上 4 2 9 在系统自动扫描 Scan Plate 后 开始 Step2 检测细胞增殖曲线 9 第二天 4 34 3 药物工作液配制及添加药物 药物工作液配制及添加药物 4 3 1 用培养基将细胞毒性药物 3 倍系列稀释 共制备 7 个浓度的工作液 工作液最高浓度为 5 M 选 择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死 而最低浓度时不会杀死细胞为标准 4 3 2 终止 step2 将 E Plate L8 从 Station 上取出 在细胞中加入配制好的工作液 10 l 4 3 3 重新将 E Plate L8 放入 Station 中 开始 step3 持续测量 72 小时 5 5 典型结果及数据分析典型结果及数据分析 Paclitaxel 引起的浓度依赖性作用曲线及计算的 IC50 100nM 33 3nM 11 1nM 3 7nM 1 23nM 0 41nM 0 14nM Control Time after add drug 24hr48hr72hr IC5013 8nM18 3nM30 3nM 实验实验 3 3 细胞黏附实验细胞黏附实验 1 1 概述概述 细胞黏附性是维持组织结构稳定的基本条件 也是细胞运动和发挥功能的调节因素 并且对 细胞的增值 分化有重要影响 通常可分为两类 即细胞与细胞黏附和细胞与基质黏附 机体内许多细胞 如上皮细胞 需 要牢固地定在某处发挥功能 另一些细胞 如白细胞 活跃运动 就需要不断调节细胞黏附 细胞黏 附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用 恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力 提示这些细胞相互识别及黏附机制发生了改变 2 2 实验目的实验目的 用 iCelligence 细胞分析系统细胞使用外基质蛋白或者抗体等包被电极传感器来观察细胞黏 附和铺展过程的变化 实验材料 实验材料 细胞株 3T3 ATCC Cat No CRL 1658 仪器设备 CO2 培养箱及其它细胞培养设备 iCELLigence系统 E Plate L8细胞培养板 试剂 3T3 细胞培养基 DMEM Hyclone SH30022 01 containing 10 Donor Bovine Serum FCS Invitrogen Cat No16030 074 1 Penicilline Streptomycin solution Gibco Cat No 15140 122 0 05 Trypsin EDTA Gibco Cat No 25300 054 Phosphate buffered saline PBS Hyclone Cat No SH30256 01B Fibronectin 1 mg ml 0 1 w v Sigma Cat No F1141 1MG 4 4 实验操作流程实验操作流程 4 14 1 E plateE plate L8L8 包被包被 4 1 1 将 Fibronectin 配制成 10ug ml 的工作液备用 4 1 2 在 E Plate L8 的孔中加入 150 l 10ug ml 的 FN 工作液 将 E Plate L8 置于 CO2 培养箱 30min 11 4 1 3 取出 E Plate L8 检测板 吸出 Fibronectin 4 2 细胞悬液准备 细胞悬液准备 4 1 1 取出 3T3 细胞 在超净工作台内 于无菌条件下 吸除培养皿内旧培养液 4 1 2 以 PBS 液清洗 1 2 次 于培养皿内加入 1mL T75 培养瓶 含 EDTA 的胰蛋白酶溶液 盖好盖 置 37 C 温箱中温育 2 6 min 后 在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况 若细胞质回缩 细胞间歇增 大 终止消化 4 1 3 轻轻吸除消化液 加入培养基 10mL 培养瓶 用移液管反复轻轻吹打贴壁的细胞 使它们形成细 胞悬液 将细胞悬液转移到 50mL 离心管中 1000 x rpm 离心 5 min 去除上清 加入新鲜培养基 并用移液管将细胞吹打均匀 用计数板计数细胞悬液浓度后 配制成实验需要的细胞浓度 5 x 104 cells ml 4 24 2 使用使用 iCelligenceiCelligence 系统进行检测系统进行检测 4 2 1 在 E Plate L8 的孔中加入 150 l 培养基 4 2 2 将 E Plate L8 放到 iCelligence 系统上 系统会自动进行扫描 检查是否接触良好 若接触良 好则可进行下一步 4 2 3 点击主页上 New Experiment 进入 Protocol 页面 选择需要进行的实验类型 Adhesion 选择 Standard Protocol 确定实验流程 4 2 4 点击 Layout 页面 设置实验孔的细胞名称和数目 4 2 5 点击左下角开始的标志 开始检测基线 4 2 6 取出 E Plate L8 在孔中加入 300 l 混合均匀的 3T3 细胞悬液 使每孔中细胞数目为 15 000 cells 4 2 7 加入细胞悬液后立即将 E Plate L8 放到培养箱中的 iCelligence 上 4 2 8 在系统自动扫描 Scan Plate 后 开始 Step2 检测细胞黏附曲线 6 小时 5 5 典型细胞黏附实验结果典型细胞黏附实验结果 FN coating No coating 12 实验实验 4 4 受体受体 配体相互作用配体相互作用 1 1 实验背景及目的实验背景及目的 细胞通过化学信息进行通讯的能力取决于信号分子的合成与分泌以及受体与配体的相互识别和 结合 细胞通讯中 由信号传导细胞送出的信号分子必须被靶细胞接收才能触发靶细胞的应答 接收 信息的分子称为受体 信号分子则被称为配体 受体与配体相互作用 引发细胞内的一系列生物化学 反应以及蛋白间相互作用 直至细胞生理反应所需基因开始直至细胞生理反应所需基因开始表达 及 发生各种生物学效应形成 G 蛋白与配体间的相互作用是典型的受体与配体的相互作用 配体通过不同的 G 蛋白 介导影 响质膜上某些离子通道或酶的活性 继而影响细胞内第二信使浓度和后续的生物学效应 本实验通过 iCELLigence 系统实现了对 GPCR 功能的实时动态检测 在此例中 表达组胺 H1 受体 Gq 的 HeLa 细 胞在组胺刺激下的激活作用表现在短时的细胞指数变化上 使用 iCELLigence 的 GPCR 检测 除检测 敏感性与传统检测方法例如钙浓度检测和 cAMP 检测相同外 优势还体现在 可用于检测不同 G 蛋白 家族例如 Gq Gs 和 Gi 介导的信号传导通路 可用于与疾病有关的原代细胞或细胞株上的内源性受 体 既可检测短期反应亦可检测长期反应 均一性好 2 2 实验材料实验材料 检测系统 检测系统 iCELLigence 系统 检测板 检测板 E Plate L8 微金电极检测板 细胞株 细胞株 HeLa 细胞 试剂 试剂 组胺 Histamine 3 3 实验流程实验流程 第一天第一天 1 细胞悬液准备细胞悬液准备 使用常规的细胞培养处理方法 制备实验需要的 HeLa 细胞浓度 1 6 x 105 cells ml 2 iCelligenceiCelligence 系统的基线测定系统的基线测定 2 1 在 E Plate L8 的孔中加入 150 l 培养基 2 2 将 E Plate L8 放到 iCelligence 系统上 系统会自动进行扫描 检查是否接触良好 若接触良 好则可进行下一步 13 2 3 点击主页上 New Experiment 进入 Protocol 页面 选择需要进行的实验类型 Proliferat