CN102600080A一种酶促式断裂PEG化脂质材料

CN102600080ACN102600080A一种酶促式断裂一种酶促式断裂PEGPEG化脂质材料化脂质材料 10 申请公布号102600080A 43 申请公布日xx 07 25102600080A 102600080A 21 申请号xx10084929 8 22 申请日xx 03 28A61K9 127 xx 01 A61K47 42 xx 01 A61K48 00 xx 01 A61P35 00 xx 01 71 申请人四川大学地址610065四川省成都市武侯区一环路南一段2 4号 72 发明人孙逊万瑜张志荣龚涛 54 发明名称一种酶促式断裂PEG化脂质材料 57 摘要本发明提供了一种酶促式断裂PEG修饰的胆固醇脂质材料 并提供了该材料的合成方法 使用该材料制备的脂质体可躲避免疫系统的吞噬 同时在肿瘤细胞 分泌的基质金属蛋白酶的作用下 PEG可以脱落下来 既达到肿瘤靶向性的目的 又不会阻碍药物与肿瘤细胞的相互作用 该材料适用于制备抗癌药物或基因的一些载体 51 Int Cl 权利要求书1页说明书8页附图4页 19 中华人民共和国国家知识产权局 12 发明专利申请权利要求书1页说明书8页附图4页1 1页21 一种将 PEG或其衍生物与胆固醇通过MMP的底物肽相连接形成的酶促式断裂P EG化脂质材料 即PEG MMP底物肽 Chol 2 根据权利要求1所述的酶促式断裂PEG化脂质材料 其特征在于PEG MMP底物肽 Chol的结构通式如下式 I 3 根据权利要求2所述的酶促式断裂PEG化脂质材料 其特征在于式 I 中的Peptide为酶促式断裂的短肽 选自多种肿瘤高表达的基质金 属蛋白酶的底物 即MMP底物肽 4 根据权利要求3所述的酶促式断裂PEG化脂质材料 其特征在于所 述MMP底物肽选自GG IAGQ GG IWGQ GG IAGQ VPMS MRGG IP VS LRSG RPFS MIMG VPLS LTMG VPLS LYSG IPES LRAG S GESPAY YTA GGYAE LRMGG GGPLG LYAGG GPLG LWAR 代表 酶断裂位点 5 根据以上任一项权利要求所述的的酶促式断裂PEG化脂质材料 其 特征在于所述PEG或其衍生物的分子量范围为约1000 约30000道尔顿 6 以上任一项权利要求所述的的酶促式断裂PEG化脂质材料 其特征 在于所述胆固醇与MMP底物肽通过硫醚键相连 7 一种酶促式断裂PEG修饰的胆固醇的制备方法 包括以下步骤 1 PEG或其衍生物与MMP底物肽 SH连接 2 胆固醇与溴乙酰氯形成胆固醇溴乙酰酯 3 步骤 2 所得的胆固醇溴乙酰酯与步骤 1 所得的PEG MMP底物肽 SH通过硫醚键连接得到PEG MMP底物肽 Chol 8 一种由权利要求1 7任一项所述的PEG MMP底物肽 Chol制成的药物载体 所述载体优选为脂质体 微球 9 权利要求1 7任一项所述的PEG MMP底物肽 Chol在制备抗癌药物或基因的脂质体中的用途 权利要求书102600080A21 8页3一种酶促式断裂PEG化脂质材料技术 领域 0001 本发明涉及一种制备脂质体的新型的PEG化脂质材料 具 体涉及酶促式断裂PEG化脂质材料 背景技术 0002 经过多年的研究与发展 脂质体已广泛用作抗癌药 物的载体 美国FDA目前已批准脂质体制剂用于恶性肿瘤的临床治疗 如阿霉素 脂质体 柔红霉素脂质体等 Davis M E Chen Z G Shin D M Nan oparticle therapeutics An emergingtreatment modalityfor cancer Nat Rev Drug Discov xx 7 771 782 另外随着基因药物治疗的发展 脂质体在肿瘤的基因治疗领域中也 充当着重要的载体角色 0003 然而普通脂质体在肿瘤治疗的应用过程中存在以下问题传统 的脂质体在体内很容易被网状内皮系统 RES 快速清除 在体内循 环时间短从而不容易达到肿瘤部位 G L Scherphof J D H H Span jer J T P Derksen F H Roerdink Uptake andIntracellular Processingof Targetedand NontargetedLiposomes byRat KupfferCells InVivo andIn Vitro Ann NY Acad Sci 1985 446368 384 传统脂质体在体内易聚集于肝和脾 而靶向到肿瘤组织的 药物较少 特定靶向性不强 另外 传统脂质体的稳定性较差 0004 研究表明 聚乙二醇 PEG 修饰脂质体可以显著地解决传统 脂质体存在的弊端 经在脂质体膜层嵌入PEG 利用PEG的强亲水性和柔软性而在脂质体 表面形成水分子层 阻断体内生物素等分子与脂质体结合 避免了 脂质体被免疫系统吞噬 大大延长脂质体体内消除半衰期 Papahad jopoulos D A T Gabizon A Mayhew E Matthay K Huang SK Lee KD Woodle MC Lasic DD Redemann C et al Sterically stabilizedliposomes improvements inpharmacokiics and antitumor therapeuticefficacy Proc NatlAcad SciU SA 199188 11460 4 继而通过EPR效应聚集于肿瘤 H Maeda T S T Konno Mech anism oftumor targeteddelivery ofmacromolecular drugs including theEPR effectin solidtumor andclinical overviewof theprototype polymericdrug SMANCS J Control Releasexx 74 47 61 另外 在亲水性PEG的保护下 脂质体之间的聚集减小 从而在储存 期的稳定性增强 0005 PEG修饰脂质体虽然可以很好地提高脂质体在体内的性能 但 是PEG也抑制了脂质体和肿瘤细胞之间的相互作用 使基因的转染效 率或抗癌药物治疗效果降低 S Mishar P W M E Davis PEGylati on signi cantly affectscellular uptakeand intracellulartraf cking ofnon viral genedelivery particles Eur J Cell Biolxx 83 97 111 0006 因此PEG在修饰脂质体的应用中遇到了进退两难的局面 需要 适当的策略来解决这个难题 Hiroto Hatakeyama H A Hideyoshi Harashima A multifunctionalenvelope typenano device MEND for genedelivery totumours basedon the说明书102600080A32 8页4EPR effect A strategyfor overingthe PEGdilemma Advanced DrugDelivery Reviewsxx 63152 160 首先 最直接的方式是在PEG化的载体上连接一个主动靶向配体 从 而提高载体和靶细胞之间的选择性 结合力以及摄取 但是延伸的PEG长链仍可能会影响配体与细胞受体的结合 另一种策略是利用体内微环境的一些特征移除载体上的PEG长链 已有研究者报道通过改变PEG与脂质体材料之间的化学键 利用人的 生理或病理条件使PEG链在循环过程中或到达靶部位后从脂质体表面 脱落 以提高脂质体所携载的药物或基因进入细胞的数量 与传统长循环材料不同 可断裂PEG 脂质衍生物通常经二硫键 乙烯醚键或肽键等连接PEG与脂溶性材料 其断裂的方式一般为硫解 酸解或酶解 0007 目前研究最多的是二硫键连接的PEG与脂质衍生物 Maeda等 Maeda T F K A reduction triggered deliveryby aliposomal carrierpossessing membrane permeable ligandsandadetachable coating Colloids SurfB Biointerfacesxx 49 1 15 21 通过二硫键连接聚乙二醇与二油酰磷脂酰乙醇胺 PEG S S DOPE 修饰脂质体 实验证明加入还原剂半胱氨酸会使二硫键断裂 脂质体的内化变得 相对容易 但是二硫键在体内会很快断裂 限制了二硫键的应用 0008 研究报道 Shin J S P Thompson DH Acid triggered releasevia dePEGylationof DOPEliposomes containingacid labile vinylether PEG lipids J ControlReleasexx 91 187 200 将酸敏感的PEG 脂质材料修饰的包封钙黄绿素的脂质体与不同pH值的缓冲溶液孵育 结果表明随pH值降低 钙黄绿素释放量增加 说明所合成的PEG 脂质材料具有在酸环境下脱PEG的特性 但是体内环境复杂 pH值多变 酸敏感的PEG 脂质材料在体内的特性不易控制 Zhang等 Zhang JX Z S Mullah N Pechar M Allen TM Pharmaco attributesof dioleoylphosphatidylethanolamine cholesterylhemisuinate liposomescontaining differenttypes ofcleavable lipopolymers Pharmacol Resxx 49 185 98 以甘氨酸 苯丙氨酸 亮氨酸 甘氨酸 氨基乙醇片段连接PEG与DSPE 以可酶解的四肽作为断裂的位点 合 成的PEG GFLG DSPE四肽连接物与普通二硫键相比则表现出较高的体内稳定性和蛋 白水解断裂的敏感性 小肽片段在体内很容易被一些内源性物质降解 以达到脱掉PEG链段 的目的 0009 为了克服现有技术中PEG衍生化的脂质的一系列缺陷 尤其是 在肿瘤治疗时 避免被网状内皮系统 RES 快速清除 增加其在体 内循环时间 从而促进达到肿瘤部位 增加其肿瘤组织的特定靶向 性 提出了本发明 发明内容 0010 本发明的目的之一提供一种新型的PEG化脂质材料 以解决PEG修饰脂质体时遇到的问题 0011 本发明的目的之一提供一种PEG修饰的胆固醇类脂材料 其比 PEG修饰的磷脂类脂材料更稳定 0012 本发明的目的之一提供一种PEG修饰的胆固醇类脂材料在制备 治疗肿瘤药物中的用途 具有更好的肿瘤靶向性和体内循环时间 0013 在肿瘤研究中 基质金属蛋白酶 Matrix metalloproteinase MMP 因其对细胞外基质具有降解和重塑功能而 在肿瘤的入侵和转移过程中发挥着重要的作用 有研究指说明书102600080A43 8页5出 Chau Y Padera R F Dang N M Langer R Antitumor efficacyof anovel polymer peptide drug conjugatein humantumor xenograftmodels Int J Cancerxx 118 1519 1526 许多类型的肿瘤如乳腺癌 结肠癌 肺癌 肝癌等均过度 表达MMP 0014 本发明人因此利用MMP与其底物肽的反应 设计一种肿瘤特异 性断裂的PEG化脂质材料 因其在体内具有特异性 这种酶促式断裂 设计比pH敏感及二硫键断裂更适合用于肿瘤治疗领域 0015 现有技术中 PEG多修饰于磷脂衍生物上 本发明人通过研究证明胆固醇作为脂质体的一个重要组成成分 虽 然本身并不形成膜结构 但是能以一定比例插入磷脂膜中 稳定脂 质体的结构 而且 与磷脂相比 胆固醇的结构更稳定 更适合用 于PEG化修饰 0016 本发明的目的之一提供一种将PEG和胆固醇通过MMP的底物肽 相连接形成新型的酶促式断裂PEG化脂质材料 即PEG MMP底物肽 胆固醇 0017 本发明的酶促式断裂PEG化脂质材料制备的脂质体在PEG的掩 蔽作用下可躲避机体免疫系统的作用 延长其在血液中的循环时间 当到达肿瘤部位时 肿瘤细胞大量分泌的MMP与其底物发生相互作 用 将脂质体表面的PEG脱落下去 以避免PEG阻碍脂质体和肿瘤细 胞的接触 进而达到肿瘤靶向性 提高疗效的目的 0018 本发明的目的之一提供了一种由本发明的酶促式断裂PEG化脂 质材料制备的药物载体 优选是治疗肿瘤的化学药物或基因的载体 0019 本发明所述的载体选自脂质体 微球等 0020 本发明优选提供了一种酶促式断裂PEG修饰的胆固醇用于制备 抗癌药物或基因的脂质体的方法 0021 本发明的目的之一提供了一种酶促式断裂PEG修饰的胆固醇 PEG MMP底物肽 胆固醇 其构如下式I 0022 其中式I中的PEG指的是PEG及其衍生物 分子量优选为约1000 约30000道尔顿 进一步优选为约2000 约5000道尔顿 0023 本发明所述的PEG衍生物优选为PEG NHS 聚乙二醇 酰胺 丙酸琥珀酰亚胺酯 PEG SS 聚乙二醇 琥珀酰亚胺琥珀酸酯 PEG SC 聚乙二醇 琥珀酰亚胺碳酸酯 PEG SPA 聚乙二醇 琥珀酰亚胺丙酸酸酯 0024 作为本发明优选的实施方案之一 本发明所述的PEG衍生物进 一步优选为PEG NHS 0025 式I中的Peptide指的是MMP底物肽 优选是针对MMP 1 MMP 2 MMP 3 MMP 7 MMP 8 MMP 9 MMP 11 MMP 13等各种基质金属蛋白酶的底物肽 0026 进一步优选地 本发明的MMP底物肽包括GPLGIAGQ GGIWGQ GGIAGQ 说明书102600080A54 8页6VPMSMRGG IPVSLRSG RPFSMIMG VPLSLTMG VPLSLYSG IPESLRAG SGESPAYYTA GGYAELRMGG GGP LGLYAGG GPLGLWAR 或者GPLG IAGQ GG IWGQ GG IAGQ VPMS MRGG IPVS LRSG RPFS MIMG VPLS LTMG VPLS LYSG IPE S LRAG SGESPAY YTA GGYAE LRMGG GGPLG LYAGG GPLG LW AR等 其中 代表酶断裂位点 以上两种表达均是指的是本发明MMP底物肽 下文中不在重复列举 0027 本发明中MMP底物肽优选GPLG IAGQ或GPLGIAGQ 0028 本发明的目的之一提供了制备一种酶促式断裂PEG修饰的胆固 醇的方法 包括以下步骤 1 PEG或其衍生物与MMP底物肽 SH连接 2 胆固醇与溴乙酰氯形成胆固醇溴乙酰酯 3 所得的胆固醇溴乙酰酯与带有巯基的PEG 肽即 PEG MMP底物肽 SH或PEG衍生物 MMP底物肽 SH 通过硫醚键连接 0029 本发明的目的之一提供了制备一种酶促式断裂PEG修饰的胆固 醇的方法 优选包括以下步骤 1 用PEG或其衍生物的具有氨基活性的活化酯与短肽N端的氨基反 应 生成PEG peptide SH 0030 2 将胆固醇溶于无水四氢呋喃中 滴加适量溴乙酰氯 反应混合 液加热搅拌回流约4h 过柱纯化以后得到胆固醇溴乙酰酯 3 将PEG peptide SH溶于二甲基亚砜中 胆固醇溴乙酰酯溶于少量有机溶剂中 二者 混合 再调节pH至约7 0 8 0 在约20 30 下搅拌12 36小时 旋蒸除去有机溶剂 过滤除掉未反应完的胆固醇溴乙酰酯 纯化后得到酶促式断裂PEG修饰的胆固醇 即式I 0031 优选地 步骤 3 中的有机溶剂可选自四氢呋喃 氯仿 二氯甲烷 优选四氢呋 喃 附图说明 0032 以下 结合附图来详细说明本发明的实施方案 其 中图1PEG MMP底物肽 胆固醇的结构式 0033 图2PEG MMP底物肽 胆固醇的合成路线 0034 图3PEG2000 MMP底物肽的1H NMR图谱 0035 图4PEG2000 MMP底物肽 胆固醇的1H NMR图谱 0036 图5TLC检测PEG2000 MMP底物肽 胆固醇在肿瘤细胞上清液中的体外断裂特性1PEG2000 MMP底物肽 胆固醇溶于氯仿后点样 2PEG2000 MMP底物肽 胆固醇水溶液 同样37 孵育12h 3PEG2000 MMP底物肽 胆固醇 孵育液 4PEG2000 MMP底物肽 胆固醇 孵育液 LLC浓缩上清 0037 图6PEG2000 MMP底物肽 胆固醇断裂后的TOF MSES 图谱 0038 图7PEG2000 MMP底物肽 胆固醇修饰的阴离子脂质体腺病毒复合物 PPC AL Ad5 在肿瘤细胞中的转染效果 0039 具体实施方式说明书102600080A65 8页7 0040 以下实施例是 对本发明的进一步说明 但绝不是对本发明范围的限制 下面参照实施例进一步详细阐述本发明 但是本领域技术人员应当 理解 本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法 而且 本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替 换 组合 改良或修饰 但这些都将包括在本发明的范围内 0041 实施例1胆固醇溴乙酰酯的合成 一 将0 5mmol的胆固醇 1 93mg 溶于5ml无水THF中 滴加3mmol溴乙酰氯 250 l 反应混合液加热搅拌回流约4h TLC检测 石油醚 CH2Cl2 4 1 反 应完全 旋蒸挥去有机溶剂得到黄色的粗产品 再用硅胶柱纯化 洗脱剂为 石油醚 CH2Cl2 5 1 最后得到白色样品即Chol CO CH2Br 0042 1H NMR CDCl3 400MHz 0 6 2 25ppm m 43H cholesterol protons 3 8ppm s 2H CH2Br 4 6ppm m 1H 3 CH cholesterol 5 4ppm d 1H 6 CH cholesterol 0043 实施例2胆固醇溴乙酰酯的合成 二 将100mg胆固醇和40mg 溴乙酸溶于10ml无水CH2Cl2中 然后加入44 l N N 二异丙基碳酰亚胺和1 5mg4 二甲氨基吡啶 室温搅拌48h 旋蒸挥去有机溶剂得到黄色的粗产品 再用硅胶柱纯化 洗脱剂为 石油醚 CH2Cl2 5 1 最后得到白色固体 即Chol CO CH2Br 0044 1H NMR CDCl3 400MHz 0 6 2 25ppm m 43H cholesterol protons 3 8ppm s 2H CH2Br 4 6ppm m 1H 3 CH cholesterol 5 4ppm d 1H 6 CH cholesterol 0045 实施例3PEG peptide SH 的合成mPEG2000 NHS 购自美国sigma公司 和短肽 GPLGIAGQC SH 由上海楚肽生物科技有限公司合成 以摩尔比1 21混合 在碳酸 缓冲液 pH8 5 中 4 搅拌过夜 透析 透析袋截留分子量1000 后冻干得到白色固体即PEG2000 peptide GPLGIAGQC SH 图2PEG MMP底物肽的1H NMR图谱 实施例4PEG MMP底物肽 胆固醇 的合成将34mg的PEG2000 peptide GPLGIAGQC SH 实施例3产品 溶于2ml二甲基亚砜中 12mg的Chol CO CH2Br 实施例1产品 溶于少量四氢呋喃中 二者混合 再加入适量N N 二异丙基乙胺 调节pH至7 5左右 25 搅拌24h 旋蒸除去四氢呋喃 过滤除掉胆固醇溴乙酰酯 室温下透析过夜 透析袋截留分子量2000 最后冻干得到白色固体 PEG2000 Peptide Chol 0046 PEG2000 MMP底物肽 胆固醇的核磁谱 1H NMR CDCl3 400MHz 在PEG2000 Peptide图谱的基础上增加了胆固醇的特征峰4 6 4 7ppm 1H 3 CH cholesterol 5 33ppm 1H 6 CH cholesterol 参见图2PEG MMP底物肽的1H说明书102600080A76 8页8NMR图谱和图3PEG MMP底物肽 胆固醇的1H NMR图谱 实施例5PEG peptide SH 的合成短肽 IPVSLRSGC SH 由上海楚肽生物科技有限公司合成 15 3mg 20mmol 和mPEG500 0 SPA 购自美国sigma公司 103 5mg 20mmol 溶解于1ml DMSO中 加入5 9ml Et3N 室温下搅拌反应4小时 在蒸馏水中透析 截留分子量1000 过夜 冻干得到白色固体即PEG Peptide SH 0047 实施例6PEG MMP底物肽 胆固醇 的合成将72mg的PEG5000 peptide IPVSLRSGC SH 实施例5产品 溶于2mlDMSO 12mg的Chol CO CH2Br 实施例1产品 溶于少量四氢呋喃中 二者混合 再加入适量N N 二异丙基乙胺 调节pH至7 5左右 25 搅拌24h 旋蒸除去四氢呋喃 过滤除掉胆固醇溴乙酰酯 室温下蒸馏水中透析过夜 透析袋截留分子量2000 最后冻干得到白色固体 即PEG MMP底物肽 胆固醇 0048 实施例7PEG peptide SH 的合成mPEG20000 NHS 购自美国sigma公司 和短肽 SGESPAYYTAC SH 由上海楚肽生物科技有限公司合成 以摩尔比1 41混合 在碳酸 缓冲液 pH8 5 中 4 搅拌过夜 蒸馏水中透析 透析袋截留分子量10000 后 冻干得到白色固体即 PEG peptide SH 0049 实施例8PEG MMP底物肽 胆固醇 的合成将402 9mg的PEG20000 peptide IPVSLRSGC SH 实施例7产品 溶于2mlDMSO 12mg的Chol CO CH2Br溶于少量氯仿中 混匀 再滴加适量N N 二异丙基乙胺 调节pH至7 5左右 25 搅拌24h 旋蒸除去氯仿 过滤除掉胆固醇溴乙酰酯 室温下蒸馏水中透析过夜 透析袋截留分子量20000 最后冻干得到白色固体 即PEG MMP底物肽 胆固醇 0050 实施例9TLC检测PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇的体外断裂特性取2mg实施例4制备的PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇 用孵育液 50mmol LTris pH7 5 150mmol L氯化钠 5mmo l LCaCl2 1 mol L ZnCl2 200 l溶解后 等分成两份 一份再加入100 l孵育液 另 一份加入100 l的Lewis鼠源性肺腺癌细胞 LLC 浓缩上清 经明 胶酶谱实验验证细胞上清中含有活化的MMP 2 或100 lMMP 2溶液 含2 gMMP 2 37 孵育12h 取样品TLC检测 氯仿甲醇 5 1 0051 由图4可见 PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇在孵育液中与LLC浓缩上清中的MMP 2反应生成了新的物质 即可证实PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇会特异性地断裂 而其他对照组没有新的物质生成 说明书102600080A87 8页9 0052 实施例10TOF MS检测PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇的体外断裂特性取2mg实施例4的PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇 用孵育液 50mmol LTris pH7 5 150mmol L氯化钠 5mmo l LCaCl2 1 mol L ZnCl2 200 l溶解后 等分成两份 一份再加入100 l孵育液 另 一份加入100 l的LLC浓缩上清或100 lMMP 2溶液 含2 gMMP 2 37 孵育12h 然后用氯仿萃取 除掉水溶液里的盐类等成分 合并氯仿层挥干 溶剂 将样品用于TOF MSES 检测 0053 结果PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇与MMP作用以后 主要生成了分子量为2400左右的片段 与PE G2000 GPLG的理论分子量接近 且在该混合物中有检测到分子量为916的物 质 与IAGQC 胆固醇的分子量吻合 参见图5PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇断裂后的TOF MSES 图谱 由此可见 PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇中间的肽与LLC分泌的MMP特异性地反应 而使PEG从胆固醇上 脱落下来 0054 实施例11PEG2000 Peptide GPLGIAGQC 胆固醇修饰的阴离子脂质体腺病毒复合物 PPC AL Ad5 的制备取19 7mg卵磷脂 9 7mgCHEMS 1 9mg胆固醇溶于5ml氯 仿中混匀 旋蒸除去氯仿溶液形成脂质薄膜 加入5mlTES缓冲液 震摇数小时至脂质水化完全 然后探头超声 200W 5s 8次 形成澄清带有乳光的脂质体溶液 取1ml空白脂质体溶液加入130 l氯化钙 100mM 37 孵育1h 离心 8000rpm 10min 得到沉淀 加入一定量的TES缓冲液重悬沉淀 并加入腺病毒混匀 再加入130 lEDTA溶液 150mM 并用氢氧化钠 100mM 溶液调 节pH至7 4 震摇10min 37 孵育1h 加入100 lPPC 2 mol ml 胶体溶液 混匀后37 孵育4h 得到PPC AL Ad5复合物 0055 实施例12PPC AL Ad5在肿瘤细胞中的转染效果人成纤维肉瘤细胞HT1080在添加了10 新生牛血清 2 青霉素 链霉素的DMEM培养基中于37 5 CO2的孵 箱中培养 HT1080以1