奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程-征求意见稿-

ICS65.020.30 B44DB15内蒙古自治区地方标准DB XX/ XXXXXXXXX奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程Technical Regulations for Establishment of Hydrogen peroxide-induced Oxidative Damage Model of Bovine Mammary Epithelial Cells点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：）XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DBXX/ XXXXXXXXX目次前言III1范围12规范性引用文件13术语与定义14主要试剂及配制方法15主要仪器设备26奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建37奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的判定7前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本标准技术归口单位：内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）。本标准起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院，吉林农业大学，内蒙古大学。本标准主要起草人员：马燕芬、赵磊、吴志红、宋利文、乃门塔娜、凤英、羿静、宝华、张春华、杜瑞平。8奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建技术规程1 范围本标准规定了奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建方法。本标准适用于采用过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞产生氧化损伤模型的构建。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-1992 细胞培养实验室用水规格为一级水。3 术语与定义3.1磷酸缓冲盐溶液 phosphate buffer saline （PBS）起溶解保护试剂的作用，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl。3.2一抗 primary antibody兔多抗细胞角蛋白（cytokeratin）18单克隆抗体。将兔多抗细胞角蛋白18单克隆抗体与PBS按1:200比例配制而成。3.3 二抗 second antibodyAlexa Fluor488标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）。4 主要试剂配制除非另有说明，在细胞培养中应使用分析纯试剂。4.1 主要试剂DMEM/F12培养基；胎牛血清；双抗；胰岛素转铁蛋白硒钠；氢化可的松；两性霉素；表皮生长因子；催乳素；L-谷氨酰胺；胶原酶；PBS；75%酒精；新洁尔灭；0.25%胰酶；一抗；二抗；丙酮；甲醇；四氮唑蓝盐化合物（MTS）；二甲基亚砜（DMSO）。4.2 培养基配制完全培养基（生长培养基）（按配100 mL计算）将胎牛血清10 mL、双抗2 mL、5%胰岛素转铁蛋白硒钠0.5 mL、100 g/mL氢化可的松100L、100 g/mL两性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生长因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入85.74 mL的DMEM/F12培养基中，混匀后放置于250 mL的蓝口瓶，4保存。无血清培养基（饥饿培养基）（按配100 mL计算）将双抗2 mL、5%胰岛素转铁蛋白硒钠0.5 mL、100 g/mL氢化可的松100L、100 g/mL两性霉素B 100 L、10 ng/mL表皮生长因子10 L、50 g/mL催乳素50 L、200 mmol/L L-谷氨酰胺1.5 mL加入95.74 mL的DMEM/F12培养基中，混匀后放置于250 mL的蓝口瓶，4保存。终止培养基（按配100 mL计算）90mL DMEM/F12培养基中加入胎牛血清10 mL。4.3 部分试剂配制 100 g/mL氢化可的松将100 g氢化可的松溶于1 mL无水乙醇中，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。100 g/mL两性霉素B 将1 mg 两性霉素溶于10 mL无菌超纯水中，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。10 ng/mL表皮生长因子10 L将0.2 mg表皮生长因子溶于20 mL DMEM/F12培养基中，充分混匀，配制成10 g/mL的表皮生长因子浓贮，取100 L 10 g/mL浓贮溶于100 mL DMEM/F12培养基中，即为10 ng/mL表皮生长因子工作液，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。50 g/mL催乳素50 L将250 IU的催乳素（按25 IU/mg转换）溶于1 mL DMEM/F12培养基中，配制成浓度为10 mg/mL的贮液，取100 L 10 mg/mL浓贮溶于20 mL DMEM/F12培养基中，即为50 g/mL催乳素工作液，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。200 mmol/L L-谷氨酰胺称取2.923 g谷氨酰胺溶于100 mL DMEM/F12培养基中，即为200 mmol/L的谷氨酰胺，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。1% PBS在超净台内，将5 mL双抗加入500 mL PBS中，充分溶解，4 保存。3% PBS在超净台内，将15 mL双抗加入500 mL PBS中，充分溶解，4 保存。0.5%胶原酶称取100 mg 0.5%胶原酶粉末溶于20 mL PBS中，充分溶解，于超净台中用0.22 m滤器过滤灭菌，分装，-20保存。细胞冻存液（100 mL）将胎牛血清20 mL和二甲基亚砜（DMSO）10 mL加入到70 mL完全培养基中。3%的过氧化氢甲醇将3 mL 3%过氧化氢加入到97 mL甲醇中配制而成，0.22 m滤器过滤分装，-20保存。5 主要仪器设备超净台；CO2培养箱；倒置显微镜；25 cm2透气细胞培养瓶；90 mm细胞培养皿；24孔板；瓷盘；镊子；剪刀；贮液瓶；5 mL青霉素管；15 mL离心管；300 mL烧杯；250 mL蓝口瓶；1.5 mL Eppendof管；冻存管；4 离心机；4 冰箱；-80 冰箱；80目滤网；10 L-5 mL枪头；细胞计数仪。6 奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建6.1 奶牛乳腺上皮细胞培养6.1.1 奶牛乳腺样品采集选取肉眼观察切开后的乳腺深层组织内无出血点，切面呈肉白色，能见白色乳汁的健康奶牛乳腺组织适量，立即装入干净样品袋中带回实验室。6.1.2 奶牛乳腺样品处理首先在操作台前点燃酒精灯，取250 mL的贮液瓶，装入约200 mL含3% PBS溶液，然后将采集的乳腺样品放入已消毒过的瓷盘里，用镊子和剪刀剪掉组织外层，于深层处选取1 cm3大小的组织块若干块（注意避开导管和结缔组织），放入贮液瓶中浸泡10 min。6.1.3 奶牛乳腺上皮细胞原代培养准备好需要拿到培养间的物品：双抗，1% PBS溶液，3% PBS溶液，DMEM/F12培养基，0.5%胶原酶，5 mL青霉素管，15 mL离心管，90 mm细胞培养皿，25 cm2透气的细胞培养瓶。穿上经紫外照射消毒后的试验专用服进入细胞培养间。将紫外照射灯关闭，打开超净台并点燃酒精灯，用酒精棉将超净台擦拭干净。准备7只300 mL烧杯，放入超净台中并依次排开，前三只烧杯装入150 mL 3% PBS，后三只烧杯装入150 mL 1% PBS，中间一只烧杯装入150 mL 75%酒精。最后将装有乳腺组织块的250 mL蓝口瓶消毒后放入超净台中。从蓝口瓶里取出乳腺组织块放入第一只烧杯中，用镊子轻轻搅拌清洗30 s，转移到第二个烧杯，以此类推，将乳腺组织块从最后一只烧杯中取出放入高压后的90 mm细胞培养皿中。将全部移出烧杯的乳腺组织块在无菌培养皿中用眼科镊子和剪刀剪去组织块表层，剪取深层腺泡约1mm3的乳腺组织放入青霉素小瓶内。用眼科剪刀在青霉素小瓶中将乳腺组织块剪成糊状。将呈糊状的乳腺组织块吸至15 mL离心管中，加入1% PBS适量清洗青霉素小瓶3次转入离心管中，1300 r/min离心5 min。弃上清，向离心管中加入等体积的0.5%胶原酶。盖好离心管盖子，放入培养箱中消化1 h，消化过程中每隔20 min拿出轻轻摇晃离心管。消化完毕后，将消化后的组织块用80目滤网过滤（滤网应先用1% PBS润湿）到灭菌烧杯里，用1% PBS将离心管润洗3遍后，经滤网过滤到烧杯里。将滤网弃掉，用5 mL枪头吸取滤液于15 mL离心管（根据滤液的多少来决定个数）内，然后用1% PBS将烧杯润洗3遍，1300 r/min离心5 min。弃掉上清液，分别向15 mL离心管中加入1% PBS 3 mL清洗，轻轻吹打后，1300 r/min离心3 min。再次弃掉上清液，向其分别加入5 mL完全培养基，轻轻混匀，分别将5 mL细胞培养液全部吸出轻轻放置于25 cm2透气的细胞培养瓶中。将细胞培养瓶放入37 5% CO2培养箱中，关上CO2恒温培养箱门。收拾超净台、培养间，喷洒新洁尔灭。6.1.4 奶牛乳腺上皮细胞传代及纯化从CO2恒温培养箱内取出培养瓶，在超净台里倾倒出旧培养基。加入1% PBS润洗培养瓶2次，倒出。加入0.25%胰酶1 mL（注意让枪头从培养瓶侧面加入，不要对着细胞加），计时30 s，倒出，加入1% PBS润洗2次。加入0.25%胰酶1 mL，置于CO2培养箱中培养9 min。取出培养瓶，于倒置显微镜下观察细胞脱壁情况。乳腺上皮细胞消化完全后，迅速向瓶内加入3 mL终止培养基终止消化，防止深度消化损伤细胞，用1 mL枪头将细胞培养瓶底壁的细胞吹打下来。吸取细胞悬液于15 mL离心管中，4 离心机1300 r/min离心3 min。弃掉上清液，向15 mL离心管中加入3 mL PBS清洗，轻轻吹打后，4 离心机1300 r/min离心3 min。再次弃掉上清液，向其加入5 mL完全培养基，将细胞沉淀吹散开后全部吸出轻轻放置于25 cm2透气细胞培养瓶中。细胞计数仪计数，以1.0105的密度接种于25 cm2细胞培养瓶中。6.1.5 细胞活力测定染色：将复苏的细胞制成细胞悬液，用10 L移液枪分别吸取10 L细胞悬液和10 L 0.4%的台盼蓝，并将其混匀。计数：混匀后静置30 s，吸取20 L混合液于细胞计数板上，使混合液充满盖片和计数板之间，在荧光倒置显微镜下100计数，透明发亮的小圆圈为健康活细胞，无色；被台盼蓝染成蓝色的细胞则表示已经死亡。存活率：计数1000个细胞中被台盼蓝染成蓝色的细胞个数，细胞存活率=存活细胞个数/细胞总数量100%，由此反应出细胞的活力。6.1.6细胞生长曲线的绘制6.1.6.1 制备细胞悬液将生长良好的第三代细胞消化下来，计数后分别制成0.5104个/mL、1.0104个/mL、2.0104个/mL的细胞悬液25 mL，备用。6.1.6.2 接板吸取0.5104个/mL、1.0104个/mL、2.0104个/mL的细胞悬液于不同的24孔板内，每个浓度24个孔，每孔1 mL，放入CO2恒温培养箱中。6.1.6.3 计数细胞在CO2恒温培养箱中培养24 h后，用0.25%胰酶消化24孔板中0.5104个/mL、1104个/mL、2104个/mL的3孔细胞，分别制成1 mL细胞悬液并计数。以后每隔24 h计数一次，连续8天，未计数细胞组每2天换一次液。6.1.6.4 绘图以培养天数为横坐标，乳腺上皮细胞浓度为纵坐标，制作折线图。6.1.7 细胞免疫荧光测定纯化的奶牛乳腺上皮细胞以2104个/mL接种到24孔板中，待长至半汇合单层状态时进行下一步实验。用预冷的1% PBS缓冲液洗涤细胞3次，2 min/次，用冰浴的丙酮：甲醇（1:1）固定细胞20 min。用1% PBS缓冲液冲洗细胞3次，5 min/次，滴加1 mL 3%的过氧化氢甲醇溶液室温静置10 min，以阻断内源性过氧化氢酶。再用1% PBS缓冲液冲洗细胞3次，5 min/次，滴加1 mL 10%胎牛血清室温静置1.5 h。轻轻甩掉血清，滴加1 mL一抗兔多抗cytokeratin 18单克隆抗体（1：200），放于37的5% CO2培养箱中孵育2h。用1% PBS缓冲液清洗3次，5 min/次，在避光的条件下，滴加1 mL二抗Alexa Fluor488标记的山羊抗兔IgG，放于37的5%CO2培养箱中孵育1 h。再用PBS缓冲液冲洗3次，5 min/次，荧光倒置显微镜下，观察拍照。6.2 H2O2配制6.2.1 H2O2原液配制30% H2O2浓度约为9 mol/L。1 mol/L H2O2原液配制在1 mL H2O2中加入8 mL高压灭菌超纯水稀释到9 mL，配制成浓度为1 mol/L（1000mmol/L）的H2O2原液。6.2.2 600 mol/L H2O2工作液配制在0.006 mL 1000 mmol/L 的H2O2原液中加入9.994 mL的高压灭菌超纯水稀释到10 mL，即为600 mol/L H2O2工作液，每次换液时现配。6.2.3 600 mol/L H2O2诱导培养基配制（按20 mL计）将12 L的1000 mmol/L的H2O2原液加入到19.98 mL的无血清培养基中，即为600 mol/L H2O2诱导培养基，每次换液时现配。6.3 奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的构建6.3.1奶牛乳腺上皮细胞培养将传第三代奶牛乳腺上皮细胞使用完全培养基悬浮，并以2105个/mL或2104个/mL的密度分别接种于25 cm2细胞培养瓶或6孔板中，置于37，5% CO2培养箱中培养至细胞贴壁达80%90%时，继续于无血清培养基中饥饿培养12-16 h。6.3.2 奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型构建25 cm2细胞培养瓶或6孔板中的乳腺上皮细胞在饥饿培养12-16 h后，PBS清洗2次，分别加入5 mL/瓶或2.5 mL/孔的600 mol/L浓度的H2O2诱导培养基培养6 h后，收集细胞培养液。7 奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的判定7.1 奶牛乳腺上皮细胞数量和形态观察在倒置显微镜下观察，当奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤数量达20%-40%，氧化损伤乳腺上皮细胞形态呈现不规则椭圆形态。7.2 奶牛乳腺上皮细胞增殖率测定（MTS法）7.2.1 制备细胞悬液将复苏后的乳腺上皮细胞制成细胞悬液，使其浓度为2104个/mL。7.2.2接板向离心管中加入完全培养基，充分混匀，接到96孔板中，每组5个复孔，每孔200 L。标记好于37 5% CO