实验十叶绿素a和b含量的测定

实验十实验十 叶绿素叶绿素 a a 和和 b b 含量的测定 分光光度法 含量的测定 分光光度法 一 目的一 目的 学会学会 ChlaChla b b 含量的测定方法 了解叶片中含量的测定方法 了解叶片中 ChlaChla b b 的含量 的含量 二 原理二 原理 根据朗伯根据朗伯 比尔 比尔 Lambert Beer 定律 某有色溶液的吸光度 定律 某有色溶液的吸光度 A 值与其中溶质值与其中溶质 浓度浓度 C 以及光径以及光径 L 成正比 即成正比 即 A aCL a 为该物质的吸光系数 为该物质的吸光系数 各种有色物质 各种有色物质 溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度 而求得 如果溶液中有数种吸光物质 则此混合液在某一波长下的总吸光度等于而求得 如果溶液中有数种吸光物质 则此混合液在某一波长下的总吸光度等于 各组分在相应波长下的吸光度的总和 这就是吸光度的加和性 各组分在相应波长下的吸光度的总和 这就是吸光度的加和性 乙醇溶液中叶绿素乙醇溶液中叶绿素 a a b b 在长波光方面的最大吸收峰位于在长波光方面的最大吸收峰位于 665nm665nm 和和 649nm649nm 同 同 时在该波长时叶绿素时在该波长时叶绿素 a a b b 的比吸收系数的比吸收系数 K K 溶液厚度是 溶液厚度是 1cm 1cm 溶液浓度为溶液浓度为 1g L1g L 的的 吸光度 为已知 我们即可以根据吸光度 为已知 我们即可以根据 LambertLambert BeerBeer 定律 定律 它们的浓度它们的浓度 C 与吸光度与吸光度 A 之间有如下的关系 之间有如下的关系 A A665 665 83 31 83 31 CaCa 18 6018 60 C Cb b 1 1 A A649 649 24 54 24 54 CaCa 44 2444 24 C Cb b 2 2 1 2 1 2 式中的式中的 A A665 665 A A649 649为叶绿素溶液在波长 为叶绿素溶液在波长 665nm665nm 和和 649nm649nm 时的光密度 时的光密度 C Ca a C Cb b为叶绿素为叶绿素 a a b b 的浓度 单位为的浓度 单位为每升克数每升克数 83 3183 31 18 6018 60 为叶绿素为叶绿素 a a b b 在 在波长在 在波长 665nm665nm 时的比吸收系数 时的比吸收系数 24 5424 54 44 2444 24 为叶绿素为叶绿素 a a b b 在 在波长在 在波长 649nm649nm 时的比吸收系数 时的比吸收系数 解方程式解方程式 1 2 1 2 则得 则得 C CA A 13 713 7 A A665 665 5 76 5 76 A A649 649 3 3 C CB B 25 825 8 A A649 649 7 6 7 6 A A665 665 4 4 G G C CA A C CB B 6 106 10 A A665 665 20 04 20 04 A A649 649 5 5 此时 此时 G G 为总叶绿素浓度 为总叶绿素浓度 C CA A C CB B为叶绿素为叶绿素 a a b b 浓度 单位为浓度 单位为每升毫克每升毫克 利用 利用 上面 上面 3 3 4 4 5 5 式 即可以计算叶绿素 式 即可以计算叶绿素 a a b b 及总叶绿素的总含量 及总叶绿素的总含量 三 材料用具及仪器药品三 材料用具及仪器药品 菠菜叶片 分光光度计 天平 研钵 剪刀 容量瓶 菠菜叶片 分光光度计 天平 研钵 剪刀 容量瓶 25ml25ml 漏斗 滤纸 乙 漏斗 滤纸 乙 醇 醇 95 95 四 方法步骤四 方法步骤 1 1 称取 称取 0 20 2 克新鲜去叶脉叶片 剪碎 放在研钵中 加少许克新鲜去叶脉叶片 剪碎 放在研钵中 加少许 CaCO3 CaCO3 加入乙醇加入乙醇 10ml10ml 共研磨成匀浆 再加共研磨成匀浆 再加 5ml5ml 乙醇 过滤 最后将滤液用乙醇定容到乙醇 过滤 最后将滤液用乙醇定容到 25ml25ml 2 2 取一光径为 取一光径为 1cm1cm 的比色杯 注入上述的叶绿素乙醇溶液 另加乙醇注入另一的比色杯 注入上述的叶绿素乙醇溶液 另加乙醇注入另一 同样规格的比色杯中 作为对照 在分光光度计下分别以同样规格的比色杯中 作为对照 在分光光度计下分别以 665nm665nm 和和 649nm649nm 波长测波长测 出该色素液的光密度 出该色素液的光密度 计算结果 计算结果 五 实