细菌形态理化鉴定

1 细菌形态理化鉴定 1 形态学特征 2 2 生理生化特性实验 2 1 尿素酶 Urease 试验 2 2 氧化酶 Oxidase 试验 3 3 过氧化氢酶的测定 3 4 甲基红 Methyl Red 试验 4 5 V P 试验 4 6 含碳 氮化合物的利用 4 7 葡萄糖的氧化发酵试验 O F 实验 5 8 糖或醇类发酵试验 6 9 硝酸盐 Nitrate 还原试验 7 10 靛基质 Imdole 试验 吲哚试验 7 11 三糖铁 TSI 琼脂试验 8 12 氨基酸脱羧酶的测定 8 13 硫化氢 H2S 试验 8 14 柠檬酸盐或丙酸盐的利用 9 15 利用丙二酸盐试验 9 16 葡萄糖酸盐的氧化 9 18 半乳糖苷酶 ONPG 的测定 10 19 耐盐性试验 10 20 卵磷脂酶的测定 10 21 石蕊牛奶的反应 11 22 酪素水解试验 酪蛋白水解 11 23 酪氨酸水解 12 24 苯丙氨酸脱氨试验 12 25 产糊精结晶试验 12 26 从甘油产生二羟基丙酮 12 27 厌氧硝酸盐产气 12 28 马尿酸盐水解试验 13 29 对叠氮化钠的抗性 13 30 氰化钾试验 13 31 对溶菌酶抗性的测定 13 32 在 pH5 7 营养肉汤上的生长 13 33 需氧性试样 14 34 明胶 Gelatin 液化试验 14 35 淀粉水解试验 14 36 生长温度的测定 15 37 形成芽孢的培养基 15 38 O 129 的敏感性试验 15 2 1 形态学特征形态学特征 1 1 菌落形态 培养到 24h 后观察平板上单菌落形状 大小 颜色与突起特征 1 2 细胞形态 光学显微镜观察菌体的形态 大小 运动性等 1 3 革兰氏染色 取无油迹的干净载玻片 滴上一滴无菌蒸馏水 用接种环挑取少许菌苔 于水滴边缘轻 轻涂几下 自然风干 在火焰上通过几次 固定涂片 滴加结晶紫液 染 1min 用水冲净 结晶紫液 滴加碘液冲净残水 并覆盖约 lmin 用水冲去碘液 将片上的水甩干 滴加 95 乙 醇液脱色约 20 30s 并立即用水冲净乙醇 用番红液染 l 2min 用水洗净番红 风干 用 显微镜油镜观察涂片 1 4 芽孢染色 取培养 24h 左右的菌体涂片 干燥 固定 滴加 3 5 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上 用木夹夹住载玻片在火焰上加热 使染液冒蒸汽但勿使沸腾 切忌使染液蒸干 必要时可 添加少许染液 加热时间从冒蒸汽时开始计时约 4 5min 倾去染液 待载玻片冷却后水洗 至孔雀绿不再褪色为止 用蕃红水溶液复染 lmin 水洗 待干燥后 置油镜观察 芽孢呈 绿色 菌体呈红色 1 5 荚膜染色 按常规取菌涂片 空气中自然干燥 用 1 的结晶紫水溶液染色 2min 以 20 的硫酸铜水溶 液冲洗 用吸水纸吸干残液 干后用油镜观察 菌体染成深紫色 菌体周围的荚膜呈淡紫 色 2 生理生化特性实验生理生化特性实验 1 1 尿素酶 尿素酶 UreaseUrease 试验 试验 有些细菌能产生尿素酶 将尿素分解 产生 2 个分子的氨 使培养基变为碱性 酚红 呈粉红色 尿素酶不是诱导酶 因为不论底物尿素是否存在 细菌均能合成此酶 其活性 最适 pH 为 7 0 3 试验方法 挑取 18 24h 待试菌培养物大量接种于液体培养基管中 摇均 于 36 1 培养 10 60 和 120min 分别观察结果 或涂布并穿刺接种于琼脂斜面 不要到达底部 留底部作变色对照 培养 2 4 和 24h 分别观察结果 如阴性应继续培养至 4 天 作最终判 定 变为粉红色为阳性 培养基配制方法 培养基配制方法 蛋白胨 1 g NaCl 5 g KH2PO4 2 g 葡萄糖 1 g 琼脂 15 g 酚红 0 012g 蒸馏水 1000 ml 除酚红外 溶解上述成分 并调节 PH 为 6 8 6 9 然后加入酚红指示剂 使培养基呈橙 黄色 分装 115 灭菌 20min 待培养基冷至 50 左右 加入预先过滤除菌的 20 尿素 水溶液 使其终浓度为 2 试验方法 挑取 18 24h 待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面 不要到达底部 培养 1 4d 观察 结果 如为阴性应继续培养一下 作最终判定 变为粉红色为阳性 2 2 氧化酶 氧化酶 OxidaseOxidase 试验 试验 氧化酶亦即细胞色素氧化酶 为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶 氧化酶先使细胞 色素 C 氧化 然后此氧化型细胞色素 C 再使对苯二胺氧化 产生颜色反应 试验方法 在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂 1 2 滴 阳性者 Kovacs 氏试剂呈粉红色 深紫色 Ewing 氏改进试剂呈蓝色 阴性者无颜色改变 应在数分钟内判 定试验结果 注意事项 1 盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化 溶液应装在棕色瓶中 并在冰箱内 保存 如溶液变为红褐色 即不宜使用 2 铁 镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应 若用它来挑取菌 苔 会出现假阳性 故必须用白金丝或玻璃棒 或牙签 来挑取菌苔 3 在滤纸上滴加试剂 以刚刚打湿滤纸为宜 如滤纸过湿 会防碍空气与菌 苔接触 从而延长了反应时间 造成假阴性 3 3 过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶的测定 过氧化氢酶又称接触酶 能催化过氧化氢分解水和氧 1 试剂 3 10 过氧化氢 H2O2 2 菌种培养 将测试菌种接种于合适的培养基斜面上 适温培养 18 24h 3 试验方法 取一干净的载波片 在上面滴 1 滴 3 10 的 H2O2 挑取 1 环培养 18 24h 的菌苔 在 H2O2 溶液中涂抹 若有气泡 氧气 出现 则为过氧化氢酶 阳性 无气泡者为阴性 也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上 观察气泡的产生 4 注意事项 过氧化氢酶是 1 种以正铁血红素作为辅基的酶 所以测试菌所生长的 培养基不可含有血红素或红血球 4 4 4 甲基红 甲基红 MethylMethyl RedRed 试验 试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖 在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸 进一步分解中 由于糖代谢的途径不同 可产生乳酸 琥珀酸 醋酸和甲酸等大量酸性产物 可使培养基 PH 值下降至 pH4 5 以下 使甲基红指示剂变红 挑取新的待试纯培养物少许 接种于通用培养基 培养于 36 1 C 或 30 C 以 30 C 较好 3 5 天 从第二天起 每日取培养液 1ml 加甲基红指示剂 1 2 滴 阳性呈鲜 红色 弱阳性呈淡红色 阴性为黄色 迄至发现阳性或至第 5 天仍为阴性 即可判定结果 甲基红为酸性指示剂 pH 范围为 4 4 6 0 其 pK 值为 5 0 故在 pH5 0 以下 随酸度 而增强红色 在 pH5 0 以上 则随碱度而增强黄色 在 pH5 0 或上下接近时 可能变色不 够明显 此时应延长培养时间 重复试验 5 5 V PV P 试验试验 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸 丙酮酸缩合 脱羧成 乙酰甲基甲醇 后者在强碱环境下 被空气中氧氧化为二乙酰 二乙酰与蛋白胨中的胍基 生成红色化合物 称 V P 反应 通用培养基配制方法 通用培养基配制方法 蛋白胨蛋白胨 5g 葡萄糖 葡萄糖 5g NaCl K2PO4 一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定一般仅用于肠杆菌各菌属鉴定 5g 蒸馏水 蒸馏水 1000mL PH 7 0 7 2 分装试管 毎管装约 分装试管 毎管装约 4 5cm 115 灭菌灭菌 20min 试剂 40 NaOH 或 KOH 6 a 萘酚 试验方法 将试验菌接种于上述培养基 于 36 1 C 培养 4 天培养 48 96 小时 培养液 2ml 先加入 1ml a 萘酚 2 na phthol 纯酒精溶液 再加 40 氢氧化钾水溶液 0 4ml 摇动 2 5min 阳性菌常立即呈现红色 若无红色出现 静置于室温或 36 1 C 恒温箱 如 2h 内仍不显现红色 可判定为阴性 本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别 在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时 通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生 故应省去或以氯化钠代替故应省去或以氯化钠代替 6 6 含碳 含碳 氮化合物的利用氮化合物的利用 细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源 反映该菌是否产生代谢这种化合物的有 关酶系 因而作为鉴定依据 测定的基础培养基配方很多 因种而异 现介绍 1 种合成的 基础培养基 有些细菌还可适当补加各种维生素 培养基可制成液体 分装试管 也可制 成固体平板 可用于测定的底物种类很多 有单糖 双糖 糖醇 脂肪酸 羟基酸及其他 有机酸 醇 各种氨基酸类胺类以及碳氢化合物等 糖的含量一般为 1 醇类酚类等的 含量一般为 0 1 0 2 氨基酸的含量一般为 0 5 因碳氢化合物不溶于水 可在液体 培养基中振荡培养 或加入到 45 的固体培养基中 振荡后立即倒成平板 有些底物不宜 用高压灭菌 可用过滤法灭菌后加入已灭菌的基础培养基中 某些醇类和酚类不必灭菌 5 接种和观察结果 菌种最好做成悬液 避免带入少量碳源干扰试验结果 平板培养用 接种环点种 液体培养则用直针接种 每一测定菌必须接种未加碳水化合物的空白基础培 养基作对照 适温培养 2 5 7 天后观察 凡测定菌在有碳水化合物的培养基中生长情况 明显超过空 白培养基的生长量为阳性 否则为阴性 假若两种培养基上生长情况差别不明显 开在同 一培养基上连续移种 3 次 如差别仍不明显则以阴性论 葡萄糖 蔗糖 可溶性淀粉 木糖 甘露醇 纤维二糖 乳糖 麦芽糖 纤维素粉 甘油 甘露糖 1 菌株对碳源的利用 Mandel 盐营养液 54 NaNO32 0g L K2HPO4 1 5g L CaCl2 1 5g L MgSO4 0 3g L FeSO4 7H2O 5 0mg L MnSO4 H2O 1 6mg L ZnSO4 H2O 1 4mg L CoCl2 0 5mg L Mandel 盐营养液 2 琼脂 2 碳源 碳源分别为 葡萄糖 蔗糖 可溶性淀粉 蛋白胨水培养基 1000mL 糖发酵培养基 1 6 溴甲酚紫乙醇溶液 1 2mL 另配 20 糖溶液 10mL 调节 pH7 6 115 灭菌 30min 备用 木糖 甘露醇 纤维二糖 乳糖 麦芽糖 纤维素粉 甘油 甘露糖 每支试管内装 10 mL 培养基 制成斜面培养基 无菌下接种 每种碳源接种二管 一支不接种做对照 31 培养 连续 3 代移种 生长者为阳性 2 菌株对氮源的利用 无氮的 Mandel 盐营养液 2 琼脂上铺无菌滤纸 1 不同的氮源 氮源分别为 NH4 NO3 蛋白胨 酵母膏 尿素 每种氮源制三个斜面 其中一个做对照 无菌条 件下接种 31 培养 4d 观察结果 7 7 葡萄糖的氧化发酵试验 葡萄糖的氧化发酵试验 O FO F 实验 实验 在细菌鉴定中 糖类发酵产酸是 1 项重要依据 细菌对糖类的利用有 2 种类型 1 种是从糖类发酵产酸 不需要以分子氧作为最终受氢体 称发酵型产酸 另一种则以分子 氧作为最终受氢体 称氧化型产酸 前者包括的菌种类型为多数 氧化型产酸量较少 所 产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和 而不表现产酸 为此 Hugh 6 和 Leifson 提出一种含有低有机氮的培养基 用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或 发酵型产酸 这一试验广泛用于细菌鉴定 一般用葡萄糖作为糖类代表 也可利用这一基 础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力 1 接种 以 18 24h 的幼龄菌种 穿刺接种在上述培养基中 每株菌接 4 管 其中 2 管用油封盖 凡士林 液体石蜡 1 1 混合后灭菌 约加 0 5 1 厘米厚 以隔绝空气为闭管 另 2 管不封油为开管 同时还要有不接种的闭管作对照 适温 培养 1 2 4 7 天观察结果 2 结果观察 氧化型产酸 仅开管产酸 氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱 1 2d 后来才稍变酸 发酵型产酸则开管及闭管均产酸 如产气 则在琼脂柱 内产生气泡 8 8 糖或醇类发酵试验 糖或醇类发酵试验 原理 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异 或能利用或不能利用 能利用者 或产气或 不产气 可用指示剂及发酵管检验 有些细菌分解某些糖 醇 苷 产酸 符号 产气 符号 培养基由紫 蓝 变黄 指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸 变黄的结果 并有气泡 有些产酸 仅培养基变黄 有些不分解糖类 符号 培 养基仍为紫 蓝 色 培养基配制 一般细菌常用休和李夫森二氏培养基 蛋白胨 2g K2HPO4 0 2g NaCl 5g 糖 醇 糖苷 1 水洗琼脂 5 6g 蒸馏水 1000mL PH 6 8 7 0 溴百里酚蓝 1 水溶液 3mL 先用少量的 95 乙醇溶解 后 再加水配成 1 水溶液 先调 PH 后再加指示剂 芽孢杆菌培养基配制 NH4 2HPO4 1g MgSO4 0 2g KCl 0 2g 酵母膏 0 2g 糖 醇 糖苷 1 水 洗琼脂 5 6g 蒸馏水 1000mL 溴甲酚紫 0 4 乙醇液 2mL PH 6 8 7 0 先调 PH 后再加指示剂 将以上培养基分装试管 培养基高度约为 4 5cm 115 灭菌 20min 测定的糖 醇 糖苷 类可以包括 葡萄糖 蔗糖 甘露糖 乳糖 1 5 半 乳糖 1 5 D 山梨醇 果糖 阿拉伯糖 麦芽糖 纤维二糖 木糖 水杨苷等 注意 以上亦可用液体培养基 接种和观察结果 用 18 24h 的幼龄菌种 用穿刺针接种于培养基中 适温培养 1d 3d 5d 后观 察 颜 色变黄为阳性 不变为阴性 有气泡产生为产气 结果记录 产酸 产气 不产酸长气 法法 2 2 试验方法 以无菌操作 用接种针或环移取纯培养物少许 接种于发酵液体培养基管 若为半固体培养基 则用接种针作穿刺接种 接种后 置 36 1 0 C 培养 每天观察结果 7 检视培养基颜色有无改变 产酸 小倒管中有无气泡 微小气泡亦为产气阳性 若为半 固体培养基 则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡 有时还可看出接种菌有无动力 若有动力 培养物可呈弥散生长 本试验主要是检查细菌对各种糖 醇和糖苷等的发酵能力 从而进行各种细菌的鉴别 因而每次试验 常需同时接种多管 一般常用的指示剂为酚红 溴甲酚紫 溴百里蓝和 An drade 指示剂 注 对于糖醇类发酵现在一般用糖 醇类细菌微量生化鉴定管在 36 18 24h 即可出 结果 9 9 硝酸盐 硝酸盐 NitrateNitrate 还原试验 还原试验 有些细菌具有还原硝酸盐的能力 可将硝酸盐还原为亚硝酸盐 氨或氮气等 亚硝酸 盐的存在可用硝酸试剂检验 试验方法 临试前将试剂的 A 磺胺酸冰醋酸溶液 和 B 萘胺乙醇溶液 试液各 0 2ml 等量混合 取混合试剂约 0 1ml 加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面 立即或于 10min 内呈现红色即为试验阳性 若无红色出现则为阴性 用 萘胺进行试验时 阳性红色消退很快 故加入后应立即判定结果 进行试验时 必须有未接种的培养基管作为阴性对照 萘胺具有致癌性 故使用时应加注意 硝酸盐还原试验培养基 蛋白胨 10g 酵母膏 5g NaCl 5g KNO3 1g 蒸馏水 1000mL 调节 pH7 2 7 4 121 灭菌 20min 备用 1010 靛基质 靛基质 ImdoleImdole 试验 吲哚试验 试验 吲哚试验 某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸 生成吲哚 吲哚的存在可用显色反应表现出来 吲哚与对二甲基氨基苯醛结合 形成玫瑰吲哚 为红色化合物 试验方法 将待试纯培养物小量接种于试验培养基管 于 36 1C 培养 24h 时后 取约 2ml 培养液 加入 Kovacs 氏试剂 2 3 滴 轻摇试管 呈红色为阳性 或先加少量乙醚或二 甲苯 摇动试管以提取和浓缩靛基质 待其浮于培养液表面后 再沿试管壁徐缓加入 Kovacs 氏试剂数滴 在接触面呈红色 即为阳性 实验证明靛基质试剂可与 17 种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应 若先用二甲苯 或乙醚等进行提取 再加试剂 则只有靛基质或 5 甲基靛基质在溶剂中呈现红色 因而结 果更为可靠 吲哚试验培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 蒸馏水 1000mL 调节 pH7 6 121 灭菌 20min 备用 法 2 8 试剂 对二甲氨苯甲醛 1g 95 乙醇 95ml 浓盐酸 20ml 配置时 应先用乙醇溶液溶 解对二甲氨苯甲醛 再缓慢加入盐酸即成 此试剂不能久存 宜少量配制 并避光保存于 冰箱中或阴凉处 试验方法及结果 将细菌纯培养物接种到蛋白胨水培养基中 37 培养 24 72h 后 沿管壁缓慢加入 2 3ml 的试剂于培养物的液面上 在两层液体交界面出现红色环者为阳性 阴性反映者不变色 为了使颜色明显 在加入试剂之前 先向培养物种加入 1ml 乙醚 并充分振荡 使靛 基质溶于乙醚中 静置片刻 使乙醚层浮于培养物的液面 此时 再按上述方法徐徐加入 试剂 5 10 滴 并观察判定结果 1111 三糖铁 三糖铁 TSITSI 琼脂试验 琼脂试验 试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物 穿刺接种并涂布于斜面 置 36 1 培养 18 24h 观察结果 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气 变黄 产生硫化氢 变黑 葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄 但因量少 生成的少量酸 因接触空气而氧化 加之 细菌利用培养基中含氮物质 生成碱性产物 故使斜面后来又变红 底部由于是在厌氧状 态下 酸类不被氧化 所以仍保持黄色 1212 氨基酸脱羧酶的测定 氨基酸脱羧酶的测定 有些细菌含有氨基酸脱羧酶 使羧基释出 生成胺类和二氧化碳 此反应在偏酸的条 件下进行 当培养基含胺类时呈碱性反应 使指示剂变色 接种与观察结果 用幼龄培养液作为菌种 直接接种 接种后封油 对照管与测定管 同时接种封油 肠肝菌科的细菌于 37 培养 4 天观察 当指示剂呈紫色或带红色调的紫色 者为阳性 呈黄色者为阴性 对照管应呈黄色反应 1313 硫化氢 硫化氢 H H2 2S S 试验 试验 有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物 而产生硫化氢气体 硫化氢遇铅 盐或低铁盐可生成黑色沉淀物 试验方法 在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中 沿管壁穿刺接种 于 36 1 培 养 24 28h 培养基呈黑色为阳性 阴性应继续培养至 6 天 也可用醋酸铅纸条法 将待试 菌接种于一般营养肉汤 再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空 以不会被溅湿为适度 用管 塞压住置 36 1 培养 1 6 天 纸条变黑为阳性 硫化氢试验培养基 pH7 4 的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 100mL 硫代硫酸钠 0 25g 10 醋酸铅水溶液 1mL 9 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 100mL 加热溶解 待冷至 60 时加入硫代硫酸钠 0 25g 调至 pH7 2 装入三角瓶中 115 灭菌 15min 取出后待冷至 55 60 加 入 10 醋酸铅水溶液 无菌的 1mL 混匀即可 1414 柠檬酸盐或丙酸盐的利用 柠檬酸盐或丙酸盐的利用 某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源 及磷酸胺作为氮源 将柠檬酸分解为二 氧化碳 则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性 接种与观察结果 取幼龄菌种接种于斜面上 适温培养 3 7 天 培养基呈碱性 蓝 色 者为阳性反应 不变者则为阴性 培养基 硫酸镁 0 2g 磷酸二氢铵 1 0g 磷酸氢二钾 1 0g 枸橼酸钠 5 0g 氯化钠 5 0g 琼脂 15 0g 1 溴麝香草酚蓝酒精溶液 8 0ml 蒸馏水 990ml 制法 将各物 除溴麝香草酚蓝溶液外 混合于蒸馏水内 加热溶解 校正 pH7 0 再加入溴麝香草酚蓝液 混匀后分装试管 121 20min 高压灭菌后摆成斜面 培养基呈淡 绿色 培养基摆成斜面 将培养物划线接种 在最佳生长温度培养 7d 结果记录 微生物利用柠檬酸何在柠檬酸琼脂上的生长导致了碱性反应 因此培养基 中的溴百里芬兰指示剂由绿色变为亮蓝色 如果微生物没有利用柠檬酸且在柠檬酸琼脂上 没有生长 则培养基的颜色不发生变化 1515 利用丙二酸盐试验 利用丙二酸盐试验 丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂 能否利用丙二酸盐 也是细菌鉴定 中的一个鉴别性特征 许多微生物代谢有三羧酸循环 而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节 丙二酸与琥 珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 与丙二酸不被分解 所以琥珀酸脱氢酶被占据 不能释放出来催 化琥珀酸脱氢反应 抑制了三羧酸循环 接种和观察结果 用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基 于适温培养 1 2d 观察培养基变色情况 如测定培养基生长并变蓝色 表示可利用丙二酸盐 为阳性结果 反之 如测定培养基未 变色 而空白对照培养基生长 则为阴性 即不利用丙二酸盐 1616 葡萄糖酸盐的氧化 葡萄糖酸盐的氧化 10 假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌 可氧化葡萄糖酸为 2 酮基葡萄糖酸 葡萄糖酸无 还原性基团 氧化后形成酮基 则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐还原为砖红色的 Cu2O 沉 淀 试验方法 用 pH7 2 的磷酸缓冲液配制成含 1 葡萄糖酸盐 可用葡萄糖酸钠或葡萄 糖酸钙 的溶液 分装试管 每管 2mL 刮取适温培养 18 24 小时的菌苔至 2mL 的葡萄糖 酸盐溶液中制成浓的菌悬液 置 30 过夜 然后每管加入 0 5mL 的斐林试剂 放在沸水浴 中加热 10 分钟 试管中液体由蓝色变为黄绿 绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应 如溶 液不变色者为阴性 1717 硫化氢 硫化氢 靛基质靛基质 动力 动力 SIMSIM 琼脂试验 琼脂试验 试验方法 以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约 1 2 深度 置 36 1 培养 18 24h 观察结果 培养物呈现黑色为硫化氢阳性 混浊或沿穿刺线向外生长为有动力 然后加 Kovacs 氏试剂数滴于培养表面 静置 10min 若试剂呈红色为靛基质阳性 培养基 未接种的下部 可作为对照 本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选 与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功 效 1818 半乳糖苷酶 半乳糖苷酶 ONPGONPG 的测定 的测定 本试验应用于肠肝菌科的鉴定 测定步骤 1 将测定菌接种于 TSI 斜面上 培养于 37 18h 或其他最适温度 2 挑取 1 大环菌苔入约 0 25mL 的生理盐水中制成菌悬液 每管加 1 滴甲苯 摇 匀 有助于酶的释放 于 37 放置 5 分钟 3 在菌悬液中加入 0 25mL 的 0 75mol L ONPG 测定管置于 37 水浴培养 经 30 分 1 2 3 24h 进行观察 如有黄色者则为阳性 1919 耐盐性试验 耐盐性试验 本试验是观察渗透压对细菌生长的影响 由于不同菌类耐盐性不同 故常以此作为鉴 别特征 一般可根据不同种类的菌株 选择其适合生长的培养基 在其中加入不同量的 NaCl 接种后观察其生长与否 以判断其耐盐性 以肉汤培养液根据鉴定需要 配成不同浓度的 NaCl 如 2 3 5 5 7 10 等 培养基要求十分澄清 接种时应采用幼龄菌液 直针接 种 适温培养 3 7d 与未接种的对照管对比 目测生长情况 2020 卵磷脂酶的测定 卵磷脂酶的测定 菌体如存在有卵磷脂酶 就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱 11 接种与观察结果 将测试菌的菌液 环接在有卵黄的试管和不加卵黄的对照管中 适 温培养 1 3 或 5 天观察 假若与对照管相比较 在卵黄胰胨液中或表面 形成白色沉淀者 则为阳性反应 表示卵磷脂被分解 生成脂肪和水溶性的磷酸胆碱 说明有卵磷酶的存在 另一种方法 以无菌操作取出卵黄 放入灭菌的三角瓶中 加相当于等量的生理盐水摇匀后 取 10mL 卵黄液加入到溶化的约 50 55 的 200mL 肉汁胨琼脂培养基中 混合均匀后倒入培养 皿 制成卵黄平板 过夜后即可使用 接种与观察结果 将测试菌点接在卵黄平板上 每皿可分散点接 4 5 株菌 芽孢 杆菌以点接 1 2 株菌为宜 以不影响结果观察为度 如测试厌氧菌 则须在上面加盖无菌 的盖玻片 每株菌至少重复点接两皿 适温培养 1 2d 观察 在菌落周围形成乳白色混浊 环 表示卵磷脂被分解 生成脂肪 说明该菌株有卵磷脂酶存在 2121 石蕊牛奶的反应 石蕊牛奶的反应 牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白 在牛奶中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示 剂 石蕊在中性时呈淡紫色 酸性时呈粉红色 碱性呈蓝色 还原时则自上而下地褪色变 白 细菌对牛奶的作用有一下几种 1 产酸 细菌发酵乳糖产酸 使石蕊变红 2 产碱 细菌分解酪蛋白产生碱性物质 使石蕊变蓝 3 胨化 细菌产生蛋白酶 使酪蛋白分解 故牛奶变得比较澄清 4 酸凝固 细菌发酵乳糖产酸 使石蕊变化 当酸度很高时 可使牛奶凝固 5 凝乳酶凝固 有些细菌能产生凝乳酶 使牛奶中的酪蛋白凝固 此时石蕊 常呈蓝色或不变色 6 还原 细菌生长旺盛 使培养基氧化还原电位降低 因此石蕊还原褪色 接种与观察结果 接种待测菌株 适温培养 3 5 7d 或 14d 按上述特征观察和记录 牛奶产酸 产碱 凝固或胨化等反应 培养基 脱脂乳粉 100g 溶于 1000ml 蒸馏水中 每 100ml 脱脂牛奶加入 4ml 浓度为 25g l 石蕊 2 5g 100ml 蒸馏水 放置一夜或更长时间 过滤 的石蕊牛奶 分装试管 牛奶高度 4 5cm 113 高压蒸汽灭菌 15 20min 2222 酪素水解试验 酪蛋白水解 酪素水解试验 酪蛋白水解 牛奶平板的制备 取 5g 脱脂奶粉加入 50mL 蒸馏水中 或用 50mL 脱脂牛奶 另称 1 5g 琼脂溶于 50mL 蒸馏水中 将两液分开灭菌 待冷至 45 50 时 将两液混匀倒平板 12 即成牛奶平板 将平板倒置过夜 使表面水分干燥 然后将菌种点接在平板上 每皿可点 接 3 5 株菌 适温培养 1 3 5 天 记录菌落周围和下面酪素是否已被分解而呈透明 配制该培养基时 切勿将牛奶和琼脂混合灭菌 以防牛奶凝固 2323 酪氨酸水解 酪氨酸水解 将 L 酪氨酸 0 5g 悬浮于 10mL 蒸馏水中 8 磅 20 分钟灭菌 然后于 100mL 无菌的营 养肉汤琼脂混合 倾倒平板 待凝固后 将测试菌接种于平皿上 培养 7 到 14d 记录酪 氨酸结晶是否被水解而变透明 2424 苯丙氨酸脱氨试验 苯丙氨酸脱氨试验 某些细菌 如变形杆菌 具有苯丙氨酸脱氨酶 能将苯丙氨酸氧化脱氨 形成苯丙酮 酸 苯丙酮酸遇到三氯化铁呈蓝绿色 本试验用于肠肝菌科和某些芽孢杆菌属的鉴定 接种与观察结果 将菌种接种于该培养基斜面上 适温培养 3 7d 某些芽孢杆菌须 培养 21d 取 10 的 FeCl3水溶液 4 5 滴 滴加在生长菌苔的斜面上 当斜面和试剂液 面处呈蓝绿色时为阳性反应 表示从苯丙氨酸形成苯丙酮酸 2525 产糊精结晶试验 产糊精结晶试验 某些需氧芽孢杆菌能产生淀粉酶 使淀粉水解为糊精 该反应仅用于区别多粘芽孢菌 浸麻芽孢菌和环状芽孢菌的培养物 在大试管中 200X20mm 装碾过的小麦 或燕麦 0 5g CaCO30 2g 蒸馏水 10mL 灭菌后接种 35 培养 3 5 和 7d 后 取 1 滴卢哥尔氏 碘液混匀 干燥后 用显微镜观察有暗褐色或蓝色的六角形结晶的糊精 假若大量形成 则排列为扇形或针状 2626 从甘油产生二羟基丙酮 从甘油产生二羟基丙酮 本试验主要是用于区分醋酸单胞菌属和假单胞菌属以及某些芽孢杆菌的鉴定 生酮反 应是由相应的多元醇的脱氢酶的作用 此反应就是测定有否这些脱氢酶 接种与观察结果 融化三角瓶中的培养基 倒成平板 凝固后在平板上划短线接种 适 温培养 10 天 在平板上倒入斐林试剂 A B 混合液 以覆盖菌落为度 2 小时内检查 若 在菌落周围出现红色的晕者为阳性反应 为了能掌握这一试验 可接种多粘芽孢杆菌作阳 性对照 27 厌氧硝酸盐产气 厌氧硝酸盐产气 在厌氧情况下 有些好氧细菌 能以硝酸盐代替分子氧作为受氢体 进行厌氧呼吸 将硝 酸盐还原为气态氮 即为土壤中的反硝化作用 某些芽孢杆菌 假单胞菌及产碱菌等属的 细菌具有此反应 接种封油 以斜面菌种用接种环接种后 用凡士林油 凡士林和液体石蜡为 1 1 封管 封油的高度约 1 厘米 必须同时接种不含有硝酸钾的肉汁胨培养液作对照 13 观察结果 培养 2 7d 观察在含有硝酸钾的培养基中有否生长和产生气泡 如有气泡产 生 表示反硝化作用产生氮气 为阳性反应 但如不含硝酸钾的对照培养基也可产生气泡 则只能按可疑或阴性处理 28 马尿酸盐水解试验 马尿酸盐水解试验 本试验作为区分某些芽孢杆菌的鉴定和黄单胞菌属的鉴定之用 接种和观察结果 以幼龄菌种接种于上述培养液中 适温培养 4 周 高温芽孢菌培养 2 周 取 1mL 培养物 和 1 5mL50 的 硫酸混合 静置片刻 在酸性混合物中有针状结晶出现为阳性 证明从 马尿酸盐形成安息香酸 29 对叠氮化钠的抗性 对叠氮化钠的抗性 本试验用于高温芽孢杆菌的测定 接种和观察结果 取 1 环幼龄的菌液 接种于上述培养基中 同时接种营养肉汤作为对照 45 培养 7 至 14d 观察生长情况 30 氰化钾试验 氰化钾试验 氰化钾 KCN 是呼吸链末端抑制剂 能否在含有氰化钾的培养基中生长 是鉴别肠杆菌 科各属常用的特征之一 接种和观察结果 用幼龄菌种接种于加氰化钾的测定培养基和未加氰化钾的空白培养基中 适温培养 1 2d 观察生长情况 能在测定培养基上生长者 表示氰化钾对测定菌无毒害作用 为阳性 若在测定培养基和 空白培养基上均不生长 表示空白培养基的营养成分不适于测定菌的生长 必须选用其它 合适的培养基 而测定菌在空白培养基上能生长 在含氰化钾的测定培养基上不生长 为 阴性结果 应该注意 氰化钾是剧毒药品 操作时必须小心 培养基用毕 每管加几粒硫酸亚铁和 0 5mL20 KOH 以解毒 然后清洗 31 对溶菌酶抗性的测定 对溶菌酶抗性的测定 在 100mL 的三角瓶中 放入 60 65mL 无菌的 0 01mol L HCL 在其中加入 0 1g 溶菌酶 瓶 上塞无菌棉花 在小火上煮沸 20 分钟后 冷到室温 加无菌的 0 01mol L HCL 补足到 100mL 取 1mL 溶菌酶溶液与 99mL 无菌的肉汤培养液混合 分装无菌试管 每管 2 5mL 在含有 0 001 溶菌酶肉汤管子及无溶菌酶的营养肉汤对照管中 各接种 1 环菌液 适温培 养 5 7d 记录两管的生长情况 14 32 在 在 pH5 7 营养肉汤上的生长营养肉汤上的生长 本试验应用于芽孢杆菌属中种的鉴定 接种和观察结果 取菌液一环 接种于上述培养基中 同时接种普通肉汤液 7 2pH 作对照 适温培养 1 3d 后观察生长情况 该培养液要求十分澄清 pH 必须准确 最好用 pH 计调测 33 需氧性试样 需氧性试样 若在培养基中加入还原剂 如巯基醋酸钠和甲醛次硫酸钠等 以除去培养基中的氧气或氧 化型物质 使厌氧菌能在有氧情况下生长 接种与观察结果 用 1 小环 外径 1 5 毫米的接种环 的肉汤菌液 穿刺接种到上述培养 基中 必须穿刺到管底 30 培养 分别在 3 至 7 天观察结果 如细菌在琼脂柱表面上生 长者为好氧菌 如沿着穿刺线上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌 34 明胶 明胶 Gelatin 液化试验 液化试验 有些细菌具有明胶酶 亦称类蛋白水解酶 能将明胶先水解为多肽 又进一步水解为 氨基酸 失去凝胶性质而液化 试验方法 挑取 18 24h 待试菌培养物 以较大量穿刺接种于明胶高层约 2 3 深度或点种于 平板培养基 于 20 22 培养 7 14 天 明胶高层亦可培养于 36 1 每天观察结果 若 因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动 静置冰箱中待其凝固后 再观察其是否被 细菌液化 如确被液化 即为试验阳性 平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落 上滴加试剂 若为阳性 10 20min 后 菌落周围应出现清晰带环 否则为阴性 培养基 牛肉膏 5