黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案

黄曲霉毒素及其检测方法整体解决方案 一 黄曲霉毒素介绍 黄曲霉毒素 aflatoxin 简称为AF 是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素 它可通过多种途径污染食品和饲料 直接或间接进入人类食物链 威胁人类健 康和生命安全 对人体及动物内脏器官尤其是肝脏损害严重 该毒素是黄曲霉 和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物 普遍存在于霉变的粮食及粮食制品中 黄 曲霉毒素比较耐热 加热至230 才能被完全破坏 因此一般烹饪加工也不易消 除 二 黄曲霉毒素对人体的危害 1 引起急 慢性中毒 黄曲霉毒素是剧毒物质 其毒性相当于氰化钾的10倍 砒霜的68倍 黄曲霉 毒素属肝脏毒 除抑制DNA RNA的合成外 也抑制肝脏蛋白质的合成 黄曲 霉毒索引起人类的急性中毒事件 国内外均有许多报导 最典型的是印度的霉 变玉米事件 该事件直接导致了数十人丧生 数百人患上不同类型的肝脏疾病 2 致癌性 黄曲霉毒素有极强的致癌性 长期摄入黄曲霉毒素会诱发肝癌 它诱发肝癌 的能力比二甲基亚硝胺大75倍 是目前公认的致癌性最强的物质之一 另据世 界卫生组织报导 黄曲霉毒素含量在30 50ug kg时为低毒 50 100ug kg时为中 毒 100 1000ug kg时为高毒 1000ug kg以上为极毒 鉴于黄曲霉毒素对人类的 巨大危害性 我国对其在食品中的含量作了严格规定 其中 乳制品中黄曲霉 毒素最高允许量为5ug kg 即5ppb 三 黄曲霉毒素的种类 黄曲霉毒素主要有4种 即B1 B2 G1 G2 其中B1被认为是主要的有毒物 质 有2种这些毒素的代谢产物M1和M2 其中黄曲霉毒素B1主要存在于农产品 动物饲料 中药等产品中 黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经 羟基化代谢的产物 一部分从尿和乳汁排出 一部分存在于动物的可食部分 如乳 肝 蛋类 肾 血和肌肉中 其中以乳最为常见 黄曲霉毒素M1的毒性 和致癌性与黄曲霉毒素B1的基本相似 由于牛乳及其制品是人类 特别是婴儿 的主要食品 所以其危害性更大 四 最新政策及国标 含国外一些政策 1 自2003年8月1日起 凡在我国境内从事米 面 油 酱油 醋生产加工的 企业 其产品须经检验合格后方可上市 国家质检总局发布的 关于印发小 麦粉等5类食品生产许可证实施细则的通知 中明确规定 黄曲霉毒素B1必 须检测 2 在第八期 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局公报 中发布关于 黄曲霉毒素检测方法的最新国标 1 GB T 18979 2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层净化高效 液相色谱法和荧光光度法 2 GB T 18980 2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定 免疫亲和层净 化高效液相色谱法和荧光光度法 以上两项国标均在2003年8月1日开始实施 3 2002年2月4日欧盟决议对从中国进口或委托从中国进口的花生和花生制品实 施黄曲霉毒素强制性检测的特殊条件 五 中国及国际上对黄曲霉毒素的检测标准 1 主要国家 品名 中国标准 美国标准 欧盟 玉米 花生 花生油 坚果和干果 核桃 杏 仁 20 g kg ppb 20 g kg ppb 2 4 5 8 10 15 g kg ppb 玉米及花生仁制品 按 原料折算 20 g kg ppb 20 g kg ppb 2 4 5 8 10 15 g kg ppb 大米 其它食用油 香 油 菜子油 大豆油 葵花油 胡麻油 茶油 麻油 玉米胚芽油 米 10 g kg ppb 10 g kg ppb 2 4 g kg ppb 糠油 棉籽油 其它粮食 麦类 面粉 薯干 发酵食品 酱 油 食用醋 豆豉 腐 乳制品 淀粉类制品 糕点 饼干 面包 裱花蛋糕 5 g kg ppb 5 g kg ppb 不得检出 牛乳及其制品 消毒牛 乳 新鲜生牛乳 全脂 牛奶粉 淡炼乳 甜炼 乳 奶油 黄油 新 鲜猪组织 肝 肾 血 瘦肉 0 5 g kg ppb 0 5 g kg ppb 0 05 g kg ppb 2 其他 1 WHO FAO标准 国际卫生组织 WHO 世界粮农组织所属的食品法典委 员会 CAC 推荐食品 饲料中黄曲霉毒素最大允许量标准为总量 B1 B2 G1 G2 小于15 g kg 牛奶中M1的最大允许量为0 5 g kg 2 南非标准 1990颁布了黄曲霉毒素的最大允许标准 食品中黄曲霉毒素 总量小于10 g kg 其中黄曲霉毒素B1小于5 g kg 3 其他标准 印度标准是花生中黄曲霉毒素B1小于30 g kg 越南和阿根廷 的标准为黄曲霉毒素B1小于20 g kg 六 黄曲霉毒素检测方法 测定黄曲霉毒素测定的方法有薄层色谱法 高效液相色谱法 酶联免疫吸附 测定法 质谱法 放射免疫测定法 这些方法中 国标方法 免疫亲和柱法 是 现在国际公认的比较经济有效的分析方法 有着较好的权威性和通用性 且为 国外多个组织认可 被列为标准方法 如 美国公职分析化学家协会 AOAC 美国农业部联邦谷物检测中心 FGIS 国际纯粹与应用化学协会 IUPAC 美国食品药品行政署 US FDA 美国农业部 USDA 同时在国内被认证的机构 中国出入境检验检疫局 CIQ 七 黄曲霉毒素检测 免疫亲和柱法 方法有以下特点 1 认证机构广泛 通用性强 2 分析速度快 一个样品只需10 15分钟 其他传统的方法要做到定量分 析需要几小时至几天的时间 3 灵敏度高 测定范围广泛 0 300ppb 用荧光计可以测定0 1ppb的黄 曲霉毒素四种异构体 用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素B1 4 采用单克隆免疫技术 可以特效性地将黄曲霉毒素和其他真菌毒素分 离出来 分离效率和回收率高 正确性和可靠性强 八 黄曲霉毒素检测 免疫亲和柱法 方法具体步骤如下 1 试剂配制 1 样品提取溶剂 甲醇 水 4 1 v v 2 5mmol 磷酸盐缓冲溶液 PBS pH7 2 母液配制 1 称取 50 14gNa2HPO4 12H2O 溶解于 700ml 水中 2 称取 9 66gNaH2PO4 H2O 溶解于 350ml 水中 3 将上述两种溶液进行混合并加入 42 5gNaCl 配制成 pH7 2 5mmol 磷酸盐缓冲溶液 3 1mmol 磷酸盐缓冲溶液 PBS pH7 2 工作液配制 取 200ml 的 5mmol 磷酸盐缓冲溶液 pH7 2 稀释于 800ml 水中 4 磷酸盐缓冲溶液 PBS 吐温 Tween 配制 取 8ml 吐温 20 稀释于 92mlpH7 2 磷酸盐缓冲溶液中 5 HPLC 流动相配制 水 甲醇 乙腈 60 30 15 v v 2 样品处理方法 方法一 标准方法方法一 标准方法 该处理程序适用于样品基质中没有干扰 主要适用于大多数谷类样品的处理 1 取 20g 样品加入 100ml 提取液 甲醇 水 4 1 v v 放入匀浆机中 并高速 搅拌 5 分钟 2 用滤纸过滤上述提取液 3 取 14ml 过滤后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 缓冲溶液 pH 7 2 如果 样品量比较少 取样品体积可以适当减少 如 1 4ml 8 6ml 缓冲溶液 如混合 过程中有沉淀产生 样品需要用注射过滤器进行过滤或进行离心 4 打开净化柱上密封盖和下面堵头后 柱中的缓冲溶液会排出 直到缓冲溶液 液面达到柱中填料上层处 5 取 5 50ml 稀释后的提取液 取样体积根据分析方法的灵敏度来确定 上 AflaCLEANTM柱 在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压 但必须保证过柱 流速不大于 1 2 滴 秒 尽量让所有上样样品都通过柱子流出来 即使柱中溶剂 流干了也没有太大问题 但是要避免柱子溶剂完全流干 6 用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子 7 用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水 8 每次用 1ml 甲醇洗脱柱子 可洗 2 次 第一次加入的甲醇需用堵头堵住柱子 下端 使甲醇在净化柱中保持 5min 后 再放出收集 9 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析 方法二 标准方法加正己烷分层方法二 标准方法加正己烷分层 该样品处理方法针对样品中含有油脂比较多 如坚果类 一些香料或无花果 酱 脂肪和样品中含有一些需要用正己烷去除的杂质 1 称取 20g 样品并加入 2g 的氯化钠 2 加入 100ml 提取溶剂 甲醇 水 4 1 v v 和 50ml 正己烷于匀浆机中高速 搅拌 5min 3 静止分层 取下层液进行下一步处理 4 取下层液用滤纸过滤 5 取 14ml 过滤后的提取液加入 86ml 的 1mmolPBS 缓冲溶液 pH 7 2 如果 样品量比较少 取样品体积可以适当减少 如 1 4ml 8 6ml 缓冲溶液 如 混合过程中有沉淀产生 上柱液需要用注射过滤器进行过滤或进行离心 6 打开净化柱上端密封盖和下端堵头后 柱中的缓冲溶液会排出 直到缓冲溶 液液面达到柱中填料上层处 7 取 5 50ml 稀释后的提取液 取样体积根据分析方法的灵敏度来确定 上 AflaCLEANTM柱 在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压 但必须保证 过柱流速不大于 1 2 滴 秒 尽量让所有上样样品都通过柱子流出来 即使 柱中溶剂流干了也没有太大问题 但是要避免柱子完全溶剂流干 8 用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子 9 用气体吹扫或抽真空除去柱子中残余的水 10 每次用 1ml 甲醇洗脱柱子 可洗 2 次 第一次加入的甲醇需用堵头堵住 柱子下端 使甲醇在净化柱中保持 5min 后 再放出收集 11 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析 方法三 标准方法加正己烷分层和方法三 标准方法加正己烷分层和 PBS Tween 稀释稀释 该处理过程用于样品含有干扰杂质 主要是大部分的香料和中草药 1 此处理过程样品最大取样量为 20g 一些样品需要减少取样量可以达到比较 好的提取效果 2 称取 20g 样品并加入 2g 氯化钠 3 样品先进行均质化处理 向处理好的样品中加入 100ml 提取溶剂 甲醇 水 4 1 v v 和 50ml 正己烷于匀浆机中并高速搅拌 5min 4 提取液静止分层 取下层溶液进行下一步处理 5 取下层溶液用滤纸过滤 6 取 5ml 滤液加入 35mlPBS Tween 溶液稀释 如稀释混匀中出现沉淀 需用 注射过滤器进行过滤或离心 7 打开净化柱上端密封盖和下端堵头后 柱中的缓冲溶液会排出 直到缓冲溶 液液面达到柱中填料上层处 8 取 14ml 稀释后的提取液 取样体积根据分析方法的灵敏度来确定 上 AflaCLEANTM柱 在净化过程中可对柱子进行抽真空和加压 但必须保证 过柱流速不大于 2ml min 尽量让所有上样样品都通过柱子流出来 即使柱 中溶剂流干了也没有太大问题 但是要避免柱子完全溶剂流干 9 用 10ml 蒸馏水或纯化水清洗柱子 10 用气体吹扫或抽真空除去柱子中的残余的水 11 每次用 1ml 甲醇洗脱柱子 可洗 2 次 第一次加入的甲醇需用堵头堵住 柱子下端 使甲醇在净化柱中保持 5min 后 再放出收集 12 根据分析的需要对洗脱液进行稀释或浓缩并直接进行 HPLC 分析 3 HPLC 分析方法 黄曲霉毒素检测需要一台配有荧光检测器的 HPLC 系统 黄曲霉毒素 HPLC 分析检测条件可参照以下设定 流动相 水 甲醇 乙腈 60 30 15 v v 流速 1 2ml min 进样量 10 100 L 柱温 36 HPLC 黄曲霉毒素专用分析柱 150 4 6mm RP C18 货号 10522 荧光检测器设置 EX 365nm Em 460nm 使用柱后衍生系统 详见柱后衍生技术 或 Em 430nm 用于黄曲霉毒素 B 类的检测和 455nm 用于黄 曲霉毒素 G 类的检测 4 柱后衍生技术 在 HPLC 分析中 为提高一些检测痕量目标物的灵敏度 如黄曲霉毒素 B1 和 G1 需要对检测的目标物进行衍生化 目前在 HPLC 中 以柱前衍生法和 柱后衍生法居多 但柱前衍生法由于操作过程较繁琐 容易影响定量的准确性 不适合用于对大量样品做常规检测 而柱后衍生法操作简单 可连续反应以实 现自动化分析 适用于大量样品的连续的自动化操作 LCTech 公司现有 UVETM光化学柱后衍生设备 LCTech 的 UVETM柱后衍生设备 如图 1 P N 10519 是最简单 最便捷和 性价比高的柱后衍生设备 只要将该设备连接到 HPLC 柱出口和荧光检测器的 进口之间可以使用 该设备不需要任何试剂 HPLC 流动相的水就可以作为反 应试剂 当分析时不需要使用该设备 只要将设备电源关闭就可以了 不需要 额外的操作 图 1 LCTech 公司的 UVETM系统 图 2 Aflatoxin B1 光化学衍生到 AflatoxinB2a 的过程 虽然黄曲霉毒素 B2 和 G2 在荧光检测器上有很好的响应值 但是黄曲霉毒素 B1 和 G1 需要进行衍生才可以在荧光检测器上有好的响应值 这个过程可以通 过 UVETM在 254nm 紫外光照射下进行光化学反应完成 通过黄曲霉毒素 B1 和 G1 进行羟基化 在双键结构上加一分子水 如图 2 并产生稳定可测的荧光 这个光化学反应过程不影响其他黄曲霉毒素 B2 和 G2 化学和检测性质 一般来说 检测方法的检出限与样品前处理过程和荧光检测器的性能有关 如果仪器