酶切位点保护碱基表

精品文档 1欢迎下载 酶切位点保护碱基酶切位点保护碱基 PCR PCR 引物设计用于限制性内切酶引物设计用于限制性内切酶 酶切反应酶切反应 来源 easylabs 发布时间 2009 11 08 查看次数 12704 本本文文给给出出了了分分子子克克隆隆中中常常用用限限制制性性内内切切酶酶的的保保护护碱碱基基序序列列 如如AccI A flIII AscI AvaI BamHI BglII BssHII BstEII BstXI ClaI Ec oRI HaeIII HindIII KpnI MluI NcoI NdeI NheI NotI NsiI PacI PmeI PstI PvuI SacI SacII SalI ScaI SmaI SpeI Sph I StuI XbaI XhoI XmaI 为为什什么么要要添添加加保保护护碱碱基基 在分子克隆实验中 有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的 酶切位点 用于后续的酶切和连接反应 由于直接暴露在末端的酶切位点不 容易直接被限制性核酸内切酶切开 因此在设计PCR 引物时 人为的在酶 切位点序列的 5 端外侧添加额外的碱基序列 即保护碱基 用来提高将来酶 切时的活性 其次 在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时 相临的两个酶切位点 往往不能同时使用 因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的 酶切位点切割 该该如如何何添添加加保保护护碱碱基基 添加保护碱基时 最最关关心心的的应应该该是是保保护护碱碱基基的的数数 目 而不是种类 什么 样的酶切位点 添加几个保护碱基 是有数据可以参考的 添加什么保护碱基 如果严格点 是根据两条引物的Tm 值和各引物的 碱基分布及 GC 含量 如果某条引物 Tm 值偏小 GC 较低 添加时多加 G 或 C 反之亦反 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求 NEB 采用 了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验 实验结果对 于确定双酶切顺序将会有帮助 比如在多接头上切割位点很接近时 或者 精品文档 2欢迎下载 当切割位点靠近 DNA 末端时也很有用 在本表中没有列出的酶 则通常需在 识别位点两端至少加上 6 个保护碱基 以确保酶切反应的进行 实验方法 用 32P ATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0 1A260 单位的寡核苷酸 取 1 g 已标记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶 在 20 C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时 反应缓冲液含 70mM Tris HCl pH 7 6 10 mM MgCl2 5 mMDTT 及适量的 NaCl 或 KCl 视酶的具体要求而定 20 的 PAGE 7M 尿素 凝胶电泳分析 经放射自显影确定酶切百分率 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照 若底物有较长的回文结构 切 割效率则可能因为出现发夹结构而降低 切割率切割率 酶酶寡核苷酸序列寡核苷酸序列 2 2 hrhr2020 hrhr AccAcc I I GGTCGACCGGTCGACC CGGTCGACCGCGGTCGACCG CCGGTCGACCGGCCGGTCGACCGG 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 AflAfl IIIIII CACATGTGCACATGTG CCACATGTGGCCACATGTGG CCCACATGTGGGCCCACATGTGGG 0 0 90 90 90 90 0 0 90 90 90 90 AscAsc I I GGCGCGCCGGCGCGCC AGGCGCGCCTAGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAATTGGCGCGCCAA 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 AvaAva I I CCCCGGGGCCCCGGGG CCCCCGGGGGCCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGATCCCCCGGGGGA 5050 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 BamHBamH I I CGGATCCGCGGATCCG CGGGATCCCGCGGGATCCCG CGCGGATCCGCGCGCGGATCCGCG 1010 90 90 90 90 2525 90 90 90 90 BglBgl IIII CAGATCTGCAGATCTG GAAGATCTTCGAAGATCTTC 0 0 7575 0 0 90 90 精品文档 3欢迎下载 GGAAGATCTTCCGGAAGATCTTCC2525 90 90 BssHBssH IIII GGCGCGCCGGCGCGCC AGGCGCGCCTAGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAATTGGCGCGCCAA 0 0 0 0 5050 0 0 0 0 90 90 BstEBstE IIII GGGT A T ACCCGGGT A T ACCC0 01010 BstXBstX I I AACTGCAGAACCAATGCATTGGAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAAAAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCATCTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 0 0 2525 2525 0 0 5050 90 90 ClaCla I I CATCGATGCATCGATG GATCGATCGATCGATC CCATCGATGGCCATCGATGG CCCATCGATGGGCCCATCGATGGG 0 0 0 0 90 90 5050 0 0 0 0 90 90 5050 EcoREcoR I I GGAATTCCGGAATTCC CGGAATTCCGCGGAATTCCG CCGGAATTCCGGCCGGAATTCCGG 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 HaeHae IIIIII GGGGCCCCGGGGCCCC AGCGGCCGCTAGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAATTGCGGCCGCAA 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 HindHind IIIIII CAAGCTTGCAAGCTTG CCAAGCTTGGCCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGGCCCAAGCTTGGG 0 0 0 0 1010 0 0 0 0 7575 KpnKpn I I GGGTACCCGGGTACCC GGGGTACCCCGGGGTACCCC CGGGGTACCCCGCGGGGTACCCCG 0 0 90 90 90 90 0 0 90 90 90 90 MluMlu I I GACGCGTCGACGCGTC CGACGCGTCGCGACGCGTCG 0 0 2525 0 0 5050 NcoNco I I CCCATGGGCCCATGGG 0 0 0 0 精品文档 4欢迎下载 CATGCCATGGCATGCATGCCATGGCATG50507575 NdeNde I I CCATATGGCCATATGG CCCATATGGGCCCATATGGG CGCCATATGGCGCGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCCGGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCCGGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCCGGGAATTCCATATGGAATTCCC 0 0 0 0 0 0 0 0 7575 7575 0 0 0 0 0 0 0 0 90 90 90 90 NheNhe I I GGCTAGCCGGCTAGCC CGGCTAGCCGCGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAG 0 0 1010 1010 0 0 2525 5050 NotNot I I TTGCGGCCGCAATTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTAATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAAAAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAAAAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 0 0 1010 1010 2525 2525 0 0 1010 1010 9090 90 90 NsiNsi I I TGCATGCATGCATGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTTCCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 1010 90 90 90 90 90 90 PacPac I I TTAATTAATTAATTAA GTTAATTAACGTTAATTAAC CCTTAATTAAGGCCTTAATTAAGG 0 0 0 0 0 0 0 0 2525 90 90 PmePme I I GTTTAAACGTTTAAAC GGTTTAAACCGGTTTAAACC GGGTTTAAACCCGGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGGAGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 0 0 0 0 0 0 7575 0 0 2525 5050 90 90 PstPst I I GCTGCAGCGCTGCAGC 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90 5050 5050 SphSph I I GGCATGCCGGCATGCC CATGCATGCATGCATGCATGCATG ACATGCATGCATGTACATGCATGCATGT 0 0 0 0 1010 0 0 2525 5050 StuStu I I AAGGCCTTAAGGCCTT GAAGGCCTTCGAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTTAAAAGGCCTTTT 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 90 XbaXba I I CTCTAGAGCTCTAGAG GCTCTAGAGCGCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCATGCTCTAGAGCA 0 0 90 90 7575 0 0 90 90 90 90 精品文档 6欢迎下载 注释 1 如果要加在序列的 5 端 就在酶切位点识别碱基序列 红色 的5 端 加上相应的碱基 黑色 相同如果要在3 端加保护碱基 就在酶切位 点识别碱基序列 红色 的 3 端加上相应的碱基 黑色 2 切割率 正确识别并酶切的效率 3 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基 CTAGTCTAGACTAGCTAGTCTAGACTAG7575 90 90 XhoXho I I CCTCGAGGCCTCGAGG CCCTCG