荧光分光光度法测定药液维生素B2含量总论ppt课件.ppt

荧光分光光度法测定药液维生素B2的含量 实验目的 学习荧光分光光度法测定药液中维生素B2的分析原理 掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药液中维生素B2的方法 1 实验原理 常温下 处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子 激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级 再以辐射跃迁的形式回到基态 发出比吸收光波长长的光而产生荧光 在稀溶液中 荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系 当实验条件一定时 荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系 这是荧光光谱法定量分析的理论依据 2 a 与紫外 可见分光度法比较 荧光分析法具有更高的灵敏度 b 选择性好 荧光法既能依据发射光谱 又能依据吸收光谱来鉴定物质 c 所需试样量少 操作方法简便 3 激发光谱 固定测量波长 选最大发射波长 化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线 激发光谱曲线的最高处 处于激发态的分子最多 荧光强度最大 发射光谱 固定激发光波长 选最大激发波长 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线 固定发射光波长进行激发光波长扫描 找出最大激发光波长 然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描 找出最大荧光发射波长 激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键 激发光谱 发射光谱 4 常用的荧光分析仪器由激发光源 单色器 液槽 检测器和显示记录器五部分构成 如下图所示 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点 a 荧光分析仪器采用垂直测量方式 以消除透射光的影响 b 荧光分析仪器有两个单色器 能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰 5 a 光源 在荧光计中常用卤钨灯作光源 荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源 b 单色器 荧光计的单色器是滤光片 只能用于定量分析 荧光分光光度计采用两个光栅单色器 可获得激发光谱和荧光光谱 c 检测器 荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 仪器部件 6 维生素B2 又叫核黄素 VB2 是橘黄色无臭的针状结晶 其结构式为 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂 在中性或酸性溶液中稳定 光照易分解 对热稳定 7 维生素B2溶液在430 440nm蓝光的照射下 发出绿色荧光 其峰值波长为525nm VB2的荧光在pH 6 7时最强 在pH 11时消失 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素 光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多 故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内 且在避光条件下进行 光黄素 8 实验预习 预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理 了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2的方法 9 F96型荧光光度计 上海棱光分析仪器有限公司 5mL吸量管1只 2mL吸量管1只 50mL容量瓶7只10 0 g mL 1VB2标准溶液 置阴暗处保存 冰乙酸 AR 药用VB2试样 仪器与试剂 10 1 打开氙灯 再打开主机 然后打开计算机启动工作站并初始化仪器 2 仪器初始化完毕后 在工作界面上选择测量项目 设置适当的仪器参数 激发波长 440nm 本仪器只有356nm 发射波长 540nm 3 样品测定 4 退出主程序 关闭计算机 先关主机 最后关氙灯 基本操作 11 1 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定 在六个干净的50mL容量瓶中 分别吸取0 50 1 00 1 50 2 00 2 50和3 00mLVB2标准溶液 各加入2 00mL冰乙酸 稀释至刻度 摇匀 从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度 2 未知试样的测定 移取0 1mL试样 用少量水溶解后转入50mL容量瓶中 加2 00mL冰乙酸 稀释至刻度 摇匀 用测定标准系列时相同的条件 测量其荧光强度 实验步骤 12 1 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2 根据待测液的荧光强度 从标准工作曲线上求得其浓度 计算出