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多重PCR技术 讲解框架 第一 多重PCR技术原理第二 多重PCR实验设计 大致的如何操作1 多重PCR扩增区域的选择2 引物的设计 关键步骤 3 多重PCR反应条件的确定第三 多重PCR条件优化1 反应体系优化2 引物设计3 模板核酸质量4 循环参数优化第四 多重PCR技术结果分析第五 多重PCR技术在食品中的应用 一 多重PCR技术原理 PCR是什么 聚合酶链式反应 是一种体外快速扩增特定基因或DNA片段的分子生物学技术 其基本原理是 以一对寡核苷酸为引物 在模板DNA dNTP 脱氧核苷三磷酸 适当缓冲液Mg2 的混合体系中 在DNA聚合酶的催化下 根据碱基互补配对原则 对引物所界定的DNA片段进行扩增 这种扩增通过模板DNA与引物之间的变性 退火和延伸三个步骤为一循环 每次循环产生的DNA片段作为下次循环的模板 所以PCR扩增产物呈指数增加 多重PCR是在传统PCR原理的基础上进行改进 即在同一体系中加入多对特异性引物 对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增出多个目的DNA片段 二 多重PCR实验设计 大致的如何操作 所要求的东西主要是 菌株 培养基 供试药物 试剂培养基 分离培养基 增菌培养基主要试剂 TaqDNA聚合酶 dNTPs主要仪器 PCR仪 恒压恒流电泳仪 凝胶成像仪 常温离心机 浴式振荡器 电热恒温水浴锅等等 操作方法 第一 多重PCR扩增区域的选择由分析目的来决定 缺失分析选择扩增外显子法医学鉴定个体差异选择扩增高度多态性标志微生物鉴别分析可能利用种或株DNA特异性变化区域转基因检测则选择转入的动植物基因座性别鉴定一般挑选X或Y性染色体上特有的基因座 第二 引物的设计 关键步骤 1 引物位置的确定 首先需要知道所选择的基因引物位点的详细DNA序列信息 引物的DNA序列应该有很强的特异性 否则引物会结合在其他位点上发生非特异性扩增 2 引物序列的测定 引物的设计是多重PCR成功的重要保证 事先通过GDB 基因数据库 NCBI 生物技术信息中心 查引物相关位点的DNA序列信息 3 引物序列的比较 引物间连续互补不能超过4bp 以防止发生交叉错配 第三 多重PCR反应条件的确定 首先进行单个PCR 分别设定各引物对反应条件 然后 依次增加引物对 不断调整反应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带 多重PCR技术在植物病毒检测中温度的确定 三 多PCR条件优化 多重PCR是在传统PCR基础上改进并发展起来的 但并不是单一PCR的简单混合 在实际操作中常常受到反应条件和反应体系等多种因素的影响 1 反应体系优化原则 1 确保所有的靶位点可以用相同的PCR程序在单个反应中得到有效的扩增 2 在使用相同的PCR程序和反应条件的单个PCR中对每对引物的量进行优化 以达到最大的扩增效率 3 平衡多重PCR中每对引物的量 使之对每个靶点都能获得足够的扩增量 2 引物设计 关键优化 多重PCR中的每对引物必须满足单引物PCR体系的引物设计原则 这些原则包括 引物与模板的序列紧密互补 长度一般为15 30bp GC含量一般为40 60 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 即错配 由于多重PCR体系中同时存在多对引物 在引物设计时还应注意 各引物对必须保持高度的特异性 避免非特异扩增 尽可能避免所有引物间的相互作用 各引物对应保持相对一致的扩增效率 且不同引物对扩增出来的产物能通过电泳或其他方法区分开 3 模板核酸的量 模板核酸的量和纯度是PCR成败的关键环节之一 模板量太少 会出现阴性结果或条带很弱 模板量太多则会出现条带弥散 模糊不清 模板纯度低或被降解会导致扩增的不整齐 模板核酸片段还必须具有高度的特异性 以避免非特异性扩增 保证检测的准确性 另外 各片段长度应具有明显差异 以有利于扩增后产物的区分 4 循环参数的优化 在传统PCR反应中 一个体系通常采用一个退火温度 在多重PCR体系中 不同长度的模板核酸片段 不同的引物对所要求的退火温度不一样 黄银花等人通过研究证实 在15uL的反应体系中含有多个退火温度的多重PCR反应条件的扩增效果比采用一个退火温度的效果好 基本能满足多重PCR的要求 一般来说 在解链温度Tm值允许范围内 选择较高的退火温度 多重PCR的退火时间比传统PCR稍微延长 有助于引物与模板的完全结合 延伸时间则要根据模板核酸的长度决定 黄银花等经过反复的优化实验发现 多重PCR的延伸时间比传统PCR循环时延伸时间为40s长 他们认为循环时延伸时间为1min的扩增效果好 扩增产物加尾整齐 5 反应体系优化 由于多重PCR体系中加入多对引物 因此反应体积和反应体系中的各成分也应做相应的调整 有学者通过实验认为 20uL与15uL的反应体积能达到多重PCR扩增要求 并同时对PCR缓冲液进行了改进 认为多重PCR理想的缓冲液为 1 5mmol LMgCl 50mmol LKCl 10mmol LHClpH 8 3 1mmol LTMAC 0 01 明胶 同时有研究表明 Mg2 浓度与dNTP浓度有相关性 对于一个25uL的反应体系 当Mg2 浓度为1 5mmol L时 dNTP推荐浓度为200umol L 多重PCR反应体系中 不同的反应会不同程度的竞争DNA聚合酶 因此在反应体系中适当多加入一些DNA聚合酶 可获得更佳的扩增效果 四 多重PCR的结果分析 某些多重PCR系统 特别是那些鉴别点突变或其他微小变化的系统 其PCR产物除琼脂糖电泳外 还需要进一步的分析 许多已建立的单个PCR产物分析技术可以直接应用于多重PCR分析 如限制性内切酶消化 放射性探针杂交 毛细管电泳和单链构象多态性 SSCP 分析都可以用来做多重PCR产物的常规分析 五 多重PCR技术在食品中的应用 多重PCR在食品安全检测中的应用多重PCR技术在肉品致病菌检测中的应用应用多重PCR技术检测肉品中的致病菌主要是根据该菌的特异性基因设计出合适的引物 对基因的高度保守区进行扩增 对肉品中单一病原菌的检测对于血清型较为复杂的病原细菌 如沙门氏菌 致病性大肠杆菌等 采用传统PCR检测单一基因片段 特异性不高 影响检测样品的有效性 多重PCR技术针对病原菌多个高度保守的基因序列设计引物进行扩增 提高特异性 减少假阳性 多重PCR技术在病原检测中的应用 应用多重PCR方法对感染性疾病病原检测上要有两个方法 一是针对每一种病原的单个特异基因进多重检测 同时检测一种或几种病原体的存在与否 一是针对某一病原的多个基因进行多重检测 可以减少假阳性结果的出现 可系统组合的有 肝炎病毒的感染 在同一病人或同一供血者体内 有时存在多种肝炎病毒重叠感染 如 甲 乙 丙型肝炎病毒重叠 甲 乙型肝炎病毒重叠 已 丙型肝炎病毒重叠等 肠道敛病性细菌的检测 如伤寒 痢疾和霍乱 有时具有较相同的肠道症状 有时痢疾 霍乱同一个病人并同时发病 性传播疫病 梅毒 淋病及艾滋病的检测 战伤细菌及生物战剂细菌的检测 如破伤风杆菌 产气荚膜杆菌 炭疽杆菌 鼠疫杆菌等的质检 存在问题和技术展望 多重PCR在实际应用中一旦有极少量外源性DNA污染 就可能出现假阳性结果 多对引物同时扩增 各种试验条件控制不当 很容易导致扩增失败或非特异性产物 引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和