分子生物学分子杂交技术ppt课件.ppt

分子杂交及生物芯片技术 参考书 屈伸刘志国 目录第一章生物大分子制备和分析常用技术第二章蛋白质 核酸的提取与分离第三章PCR技术第四章分子杂交与印迹技术第五章分子克隆技术第六章外源基因转移技术第七章蛋白质表达技术第八章分子标技术第九章分子改造技术第十章测序及人工合成技术第十一章基因组学技术第十二章蛋白质组学技术第十三章生物芯片技术第十四章生物信息学技术 参考书 马文丽郑文岭彭翼飞 目录 第一章核酸的分子结构与分子杂交的基本原理第二章核酸分子杂交的类型第一节固相核酸分子杂交类型一 菌落原位杂交 colonyinsituhybridization 二 斑点杂交 dotblot 三 southern印迹杂交 southernblot 四 northern印迹杂交 northernblot 五 组织原位杂交 tissueinsituhybridization 第三章核酸探针的种类 标记及检测第一节核酸探针的种类dna探针cdna探针rna探针寡核苷酸探针第二节核酸探针的标记和检测放射性同位素非放射性核酸探针第四章核酸分子杂交实验因素的优化探针选择标记方法浓度杂交率杂交最适温度杂交的严格性反应时间杂交促进剂第五章斑点杂交 第六章southern印迹杂交第一节southern印迹杂交的基本原理一 dna从凝胶到膜上的转移方法二 southern杂交膜三 核酸探针的标记第二节southern印迹法的基本过程一 dna样品的酶切和电泳二 准备用于转移的凝胶三 dna从琼脂糖凝胶转移到固相支持物四 探针标记五 杂交六 洗膜七 杂交结果的检测八 杂交膜的重复使用九 注意事项十 杂交严谨性第七章northern印迹杂交第八章原位杂交第九章菌落原位杂交第十章dna芯片技术 基本概念 变性 复性 分子杂交 异源互补的核苷酸序列通过Walson Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子的过程称为分子杂交 分子杂交技术 凝胶电泳分离待测DNA RNA Pr并转移固定到支持物或结合物上 然后与探针 抗体杂交分析 探针 Probe 已知序列的标记单链核酸片断 用于检测与其互补的待测核酸 BasepairingoccursinduplexDNAandalsoinintra andinter molecularinteractionsinsingle strandedRNA orDNA 基本概念 原位杂交 Insituhybridization ISH 菌落原位杂交 ColonyISH 组织原位杂交 TissueISH 胚胎原位杂交 EmbryoISH 斑点 狭缝杂交 Dot slotblot 基本概念 Bio chip 生物芯片 DNAchip microarrayGenechip microarrayOligonucleotidemicroarraycDNAchipProteinchipmicroRNAchipLab on chip 芯片实验室 分子杂交技术 生物大分子的印迹杂交技术 分子杂交技术 定义 凝胶电泳分离待测DNA RNA Pr并转移固定到结合物上 然后与探针 抗体杂交分析原理 核酸变复性 序列互补 抗原 抗体基本工艺 凝胶电泳 原位处理 样品转移及固定杂交分析 免疫结合分析 分子杂交技术 1969 Insituhybridization ISH 1975 Southern Southernblot DNA1977 Alwine Northernblot RNA1979 Towbin Westernblot Pr1982 Reinher Easternblot Pr IEF 分子杂交技术 探针 探针基本条件 特点 标记物 32p 35S 125I Digoxigenin FITC 单链核酸 ssDNA sscDNA 更常用 高特异性 500bp 标记物稳定灵敏 检测方便安全 分子杂交技术 探针 探针的种类DNAprobe 基因copy数 病原基因诊断 cDNAprobe 基因表达等最常用 RNAprobe ISH Oligonuleotide probe 25 50bp 基因诊断 SNP分析 测序 点突变检测 分子杂交技术 探针 探针标记物放射性标记物 N dNTP 32p 14d 35S 87d 3H 12y 125I 60d 非放射性标记物半抗原 生物素 地高辛荧光素 异硫氰酸荧光素 FITC 分子杂交技术 探针 32P dNTP结构 分子杂交技术 探针 分子杂交技术 探针 探针标记随机引物法缺口平移法 DNaseIandDNA聚合酶I 末端标记法碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶 32p ATP标记DNA RNA 5 末端转移酶 poly N n T4DNA聚合酶 Klenow片断 粘末端补平 分子杂交技术 探针 探针纯化乙醇沉淀法凝胶过滤法 G 50Spincolumn 分子杂交技术 印迹 印迹 转膜 支持物 硝酸纤维素膜 NC膜 尼龙膜N nylon DNA RNA 中性膜PVDF膜 westernblot 分子杂交技术 印迹 印迹 转膜 方法 毛细管虹吸转移法真空转移法电转移法 分子杂交技术 印迹 毛细管虹吸转移法 分子杂交技术 印迹 电转移法 分子杂交技术 印迹 真空转移法 1h 分子杂交技术 印迹 真空转移装置 分子杂交技术 印迹 Westernblot SDS PAGE及转膜系统 分子杂交技术 影响因素 离子强度 高 消除静电斥力 利于杂交 温度 低于Tm20 25 有机试剂 去离子甲酰胺 降低Tm样品 探针分子的大小和复杂程度洗涤条件 高严谨性 洗去非特异性结合探针 支持物添加物 吸附DNA探针 使DNA接触面增大 预杂交 为减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合 杂交前用封闭物将这些非特异位点封闭 变性的非特异性DNA 常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA 当与滤膜一起孵育后 除滤膜上已吸附样品DNA的区域外 它们可被吸附到所有其它区域 使整个背景覆盖一层 由于它们与探针无同源性 在交杂反应中可大大减少探针的非特异性结合 使背影清晰 高分子化合物 某些高分子化合物具有封闭膜上非特异位点的能力 一般常用Denhard t溶液 包括聚乙烯吡咯酮 小牛血清白蛋白 聚蔗糖 分子杂交技术 基本流程 样品及探针制备样品电泳分离转膜预杂交杂交洗膜分析 压片 显色 荧光观察等 分子杂交技术 SouthernblotDNA提取酶切电泳 拍照转膜 固定探针制备预杂交杂交洗膜扫磷屏 分子杂交技术 UV交联仪 多用途254nm紫外辐射系统 主要用于将核酸交联于膜上 还用于琼脂凝胶中DNA的切割 RecA突变筛选 胸腺二聚体产生的部分限制性内切酶消化 UV灭菌消除PCR污染 另紫外灭菌 聚合物紫外处理 分子杂交技术 Southernblot应用DNA多态性分析 RFLP分析 SNP SSCP RAPD 基因突变检测基因copy数检测重组子筛选DNA指纹分析测序 分子杂交技术 Southernblot应用DNA指纹分析 血迹中的DNA 分子杂交技术 Northernblot基因表达分析mRNA长度及半定量分析 分子杂交技术 Westernblot蛋白提取 样品准备SDS PAGE电转 丽春红S染色封闭一抗孵育洗涤一抗二抗孵育洗膜结果观察 显色 Dig AP FITC 分子杂交技术 ISH胚胎 组织制备固定消化 再固定 洗涤RNA探针制备封闭杂交 洗涤一抗 洗涤二抗 洗涤显色 Dig FITC Cy5 抗衰老基因Klotho原位杂交图 分子杂交技术 FISH 生物芯片Biochip 生物芯片 定义 在斑点杂交基础上 模拟制备大规模集成电路的基本原理 集成了探针原位合成 照明平板印刷 精密控制 激光共聚焦显微技术发展来的一门分子生物学技术原理 将大量样本固定于较小的支持物上 然后与标记好的待测样品杂交 再检测杂交信号的强弱 从而判断样本中待测DNA RNA Pr等分子数量或活性状态特点 高通量 微型化 集约化 标准化等 生物芯片 生物芯片 种类微阵列芯片 基因芯片 蛋白芯片 细胞芯片等 微流控芯片 属于主动式芯片 如样品制备芯片 PCR芯片 毛细管电泳芯片和色谱芯片等 芯片实验室 以生物芯片为基础的集成化分析系统 可完成如样品制备 试剂输送 生化反应 结果检测 信息处理和传递等一系列复杂工作 生物芯片 基本流程 芯片制备原位合成法 原位光照蚀刻微量点样法样品制备 Sample Cy3 Control Cy5 分子杂交检测分析 Confocus CCD 生物芯片 原位光照蚀刻原理石英片氢化后封闭设计11um见方窗口遮罩对封闭部分光解将nt加入通过化学偶合连接到晶片上更换不同的遮罩进行UV光解加入nt进行化学偶合反应重复上两步可合成所需长度及序列的寡核甘酸 生物芯片 微量点样制备 生物芯片 激光共聚焦显微镜 生物芯片 应用 抗体芯片 AbMicroarray380 第一张商品化的抗体芯片是由美国BDClontech公司推出的 这是一张用于研究抗体的芯片 芯片上排列了378种已知蛋白的单抗 这些单抗对应的蛋白都是细胞结构和功能上十分重要的蛋白 涉及信号传导 肿瘤 细胞周期调控 细胞结构 细胞凋亡和神经生物学等广泛的领域 通过这张芯片 在一次实验中就