基因工程受体ppt课件.ppt

第四章基因工程的受体系统 1 大肠杆菌受体系统 基因复制原核细胞2 芽孢杆菌受体系统扩增场所受体系统3 其他细菌受体系统 外源基因表达场所1 酵母菌受体系统真核细胞2 哺乳动物细胞受体系统受体系统3 植物细胞受体系统 受体 宿主 Host 能支持质粒 病毒进行复制的生物体 受体系统 1 一 E coli受体系统 大肠埃希氏菌 E coli 通常称为大肠杆菌 是Escherich在1885年发现的 2 1 E coli受体系统的特点 遗传背景清楚 利于研究 繁殖快 易于获得大量基因产物 含有质粒 利于基因转移 表达非E coli基因 其潜力几乎是无限的 3 4 2 E coli受体系统的优点 遗传背景清楚 利于研究 繁殖快 易于获得大量基因产物 含有质粒 利于基因转移 表达非E coli基因 其潜力几乎是无限的 5 3 E coli受体系统的缺点 高水平表达的基因产物易发生沉淀 凝聚 不易折叠 无生物活性 基因产物纯化工艺复杂 大海捞针 基因产物受污染 内毒素 基因产物对受体菌有毒害作用 基因产物易被水解 从安全角度 并不理想 缺乏基因产物表达后加工机制 6 基因型 endA1gyrA96 nalR thi 1recA1relA1lacglnV44F Tn10proAB lacIq lacZ M15 hsdR17 rK mK 特点 具有四环素抗性和萘啶酮酸抗性 recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取 用途 分子克隆和质粒提取 Xl1 Blue菌株 endA1 eliminationofnon specificdigestionbyEndonucleaseIrecA1 ForreducedoccurrenceofunwantedrecombinationinclonedDNA 7 基因型 F ompTgaldcmlonhsdSB rB mB DE3 lacIlacUV5 T7gene1ind1sam7nin5 特点 该菌株用于以T7RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主 T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于 噬菌体DE3区的lacUV5启动子 该区整合于BL21的染色体上 该菌适合于非毒性蛋白的表达 用途 蛋白质表达 BL21 DE3 菌株 ompT mutationinoutermembraneproteinproteaseVII reducingproteolysisofexpressedproteins 8 基因型 F ompTgaldcmlonhsdSB rB mB DE3 pLysS cmR 特点 该菌株带有pLysS 具有氯霉素抗性 此质粒还有表达T7溶菌酶的基因 T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平 但不干扰IPTG诱导的表达 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达 用途 蛋白质表达 BL21 DE3 ply菌株 9 基因型 F endA1glnV44thi 1recA1relA1gyrA96deoRnupG 80dlacZ M15 lacZYA argF U169 hsdR17 rK 特点 一种常用于质粒克隆的菌株 其 80dlacZ M15基因的表达产物与pUC载体编码的 半乳糖苷酶氨基端实现 互补 可用于蓝白斑筛选 用途 分子克隆 质粒提取和蛋白质表达 DH5 菌株 10 基因型 endA1glnV44thi 1relA1gyrA96recA1mcrB lac proAB e14 F traD36proAB lacIqlacZ M15 hsdR17 rK mK 特点 部分抗性缺陷 适合重复基因表达 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选 用途 分子克隆 质粒提取和蛋白质表达 JM109菌株 11 基因型 F mcrA mrr hsdRMS mcrBC 80 lacZ M15 lac 74 recA1 ara 139 ara leu 7697 galU galK rps Strr endA1 nupG用途 高效的DNA克隆和质粒扩增 能保证高拷贝质粒的稳定遗传 TOP10菌株 12 第三节基因工程的受体系统 1 大肠杆菌受体系统原核细胞2 芽孢杆菌受体系统受体系统3 其他细菌受体系统1 酵母菌受体系统真核细胞2 哺乳动物细胞受体系统受体系统3 植物细胞受体系统 受体系统 13 二 枯草杆菌受体系统 芽抱杆菌是一类耐高温 高压及低pH值的有益微生物 14 1 枯草杆菌 Bacillussubtilis 受体系统特点 最大优点 外分泌 高水平表达 基因产物不发生沉淀 纯化基因产物相对简单 基因产物污染少 基因产物不易被水解 安全 遗传背景仅次于E coli2 缺点 转化效率相对较低 表达水平较低 15 1 乳酸杆菌受体系统的独特优势 乳酸杆菌是食品级微生物乳酸杆菌本身分泌蛋白较少 Usp45是迄今已知乳酸杆菌分泌的唯一可检测蛋白 减少了载体微生物的自身蛋白对外源分泌蛋白的干扰乳酸杆菌不产生任何细胞外蛋白酶 不会引起分泌蛋白发生细胞外的降解 三 乳酸杆菌受体系统 16 2 乳酸杆菌作为疫苗载体的优越性 在呼吸系统 消化系统 泌尿系统定植 对维持微生态平衡很重要 在发酵食物中应用了几个世纪 被认为是安全的有益微生物 免疫方便 便宜 安全 不需要注射无免疫原性 17 四 酵母菌受体系统 18 安全性更大遗传信息和生理状况更适合于真核基因表达基因产物外分泌遗传背景较清楚具基因表达后加工机制 1 酵母菌受体系统的特点 19 2 常用酵母菌受体系统 酿酒酵母甲醇酵母 20 酿酒酵母 酿酒酵母 Saccharomycesserevisiae 又名面包酵母 它是单细胞真核微生物 一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的 大肠杆菌 1 酿酒酵母表达系统表达外源基因的优点 酿酒酵母培养条件普通 生长繁殖迅速 用于表达基因工程产品时 工艺简单 可以大规模生产 有效降低生产成本 它不会产生毒素 安全可靠 酿酒酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力 特别适合于表达真核生物基因 外源基因可在酿酒酵母中分泌表达 表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化 而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响 酿酒酵母的遗传背景清楚 容易进行遗传操作 21 2 甲醇酵母受体系统的优点 含特有的AOX 醇氧化酶基因 启动子 用甲醇可以严格地调控表达 有完备的发酵方法 可以高密度连续培养 其转化子能够非常稳定地表达外源蛋白质 蛋白产量高 适应能力强 易于操作 可以在廉价的非选择性培养基中生长 基因表达产物既可在胞内 又可被分泌到胞外 分泌的异源蛋白质占所有被分泌蛋白的30 以上 利于工业规模的生产 能对要表达的多肤和蛋白质进行翻译后加工处理 甲醇酵母 毕氏酵母 22 3 巴氏毕赤酵母的优点 对外源蛋白的糖基化等更接近于哺乳动物细胞