cell signaling technology(CST)常见问题回答

Cell Signaling Technology CST 常见问题回答 常见问题回答 FAQ 1 问 如何储存 CST 的抗体 答 请将抗体的原始管储存到 20 C 不要分装 因为不要分装 因为抗体储存在含有 50 甘油的缓冲液中 所以抗体 在 20 C 仍为液体状态 不会因为反复冻融而降解 具体储存温度请参考产品说明书 2 问 如何储存 SDS 裂解的磷酸化蛋白样本 答 如果短期内使用 少于 3 个月 SDS 样本细胞裂解液可以储存在 20 C 如果长期储存 应保存于 80 C 活化的蛋白样本的降解变化很大 其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化 的蛋白 3 问 能用室温孵育抗体 1 小时代替 4 C 过夜吗过夜吗 答 不建议 CST 公司活化状态的特异性抗体用于区分一或两个翻译后修饰的氨基酸残基 这些修饰 包括磷酸化 乙酰化和酶切割 与识别总蛋白的抗体相比 大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的 亲和性 因此 通过 4 C 孵育过夜延长抗原和抗体的反应时间以获得最好的信噪比是非常关键的 4 问 当我准备细胞裂解液样品时 需使用什么缓冲液 答 请检查每个产品说明书中包含的 Western blot 操作步骤中推荐的缓冲液 CST 提供以下缓冲液 见下表 或者 如果你想自己配制 CST 网站上列出了特别的缓冲液组分 CHAPS 缓冲液专为获得细 胞质的提取物而设计 适应于 Caspase 的检测 但并非关键 5 问 CST 的抗体是否适用于全组织样本裂解物 答 CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物 但是 CST 的很多抗体已经被其他客户用于 整个组织而且取得成功 6 问 如何为磷酸化目标蛋白准备阳性细胞裂解液对照 答 请参考 CST 网站上该产品的 Western blot 图 使用图述的细胞系和药物处理 能够得到阳性对照蛋 白 也可参见 查阅 7 问 假如说明书上某个种属未被列出与 CST 抗体有交叉反应 是否意味着这个种属未 被检测过呢 答 如果可能的话 CST 科学家检测所有 CST 抗体在人 小鼠和大鼠的交叉反应性 假如我们没有获 得某个种属的阳性结果 我们就不会列出这个种属 然而 有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水 平的特定蛋白 或者 我们使用的操作对于那个特定的细胞系不起作用 因此 我们建议你比较所研究种 属和 CST 抗体验证种属修饰位点附近的肽段序列 每边 5 个氨基酸 在很多情况下 CST 抗体由 免疫人的蛋白序列产生 并通过亲和层析高度纯化 很多时候 如果序列相同 或者在非磷酸化位点只有 1 或者 2 个氨基酸的不同时 CST 抗体很有可能识别你的蛋白 8 问 使用 CST 抗体时 为什么我不能使用我自己实验室的 Western blot 操作流程 答 CST 抗体经过优化以提供最强的信号 最少的背景 使用 CST 推荐的 Western blot 操作流程 对于 终端客户的优点是节约时间和材料 9 问 为什么这个抗体用于 Western blot 效果不佳 答 这里有几个关于 CST Western blot 流程的细节 对于避免丢失信号或高背景是非常关键的 不要过度清洗膜 应在 TBS 0 1 Tween 20 中清洗三次 每次 5 分钟 过度的清洗会洗掉一抗 推 荐的清洗条件已经过优化以获得最好的信噪比 因此是最强 最干净的结果 不要过度封闭 例如超过 1 小时或者过夜 在一些抗体中发现 过度封闭会减少特异信号 确保 查阅每个产品的说明书以得到每个抗体推荐的封闭时间 一般来说 针对兔多抗或兔单抗 使用抗兔二抗 7074 针对鼠单抗 使用抗鼠二抗 7076 但是 请依然 检查 上的产品说明书 确认抗体的说明书上交叉反应部分有列出你所检测的种属 确认你的上样量达到 20 g 细胞裂解液 确认诱导的细胞裂解液样本蛋白已活化 10 问 如何确保 Western blot 结果的可重复性 答 至于为什么看起来较难重复 Western blot 结果 这里有几种可能性 要发现这种情况的原因 可考虑以下 你是如何储存抗体的 请参考问题 1 2 抗体稀释后不能重复使用 许多抗体有一个非常低的工作浓度 很可能这个浓度随着连续的 Western blot 会减少 你确定你的样本中包含活化的蛋白 细胞裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量 药物诱导时 间 细胞传代数量和储存条件不同而改变 CST 产品在其保质期内都有最佳表现 请访问 产 品 保 质 期 页 面 获 得 列表 请注意 不能分装抗体 11 问 如何使用固相抗体来做免疫沉淀 答 要得到最佳的结果 获得均匀的微珠悬浮液是重要的 以下步骤可确保同质 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶 10 分钟 倒置管子几次以获得 50 微珠 缓冲液悬浮液 假如可能 温和漩涡管子 为了迅速吸出产品 切掉吸管端头 将吸管端头插入微珠悬浮液使靠近固相抗体微珠混合物 孵育抗体和 200 g 的细胞裂解物 约 1mg ml 4 C 过夜 用推荐的抗体稀释浓度 12 问 这个抗体可用于免疫组化吗 答 检测抗体是否可用于福尔马林固定石蜡包埋 Formalin Fixed and Parrffin Embedded FFPE 样 本 是 CST 的一项常规检测 那些通过严格验证标准的抗体才会被推荐用作 IHC P 我们也在新鲜冰冻组织样 本上检测抗体 那些染色成功的才会被推荐用作 IHC F 那些推荐应用里面没有列出 IHC P 或者 IHC F 的 可能已经失败 或者没有被检测 或者我们没有用作检测的特别的组织样本 建议你联系 CST 我们可能 有该抗体在其它系统表现良好的数据 或者 我们可能有适用于组织染色的更好的其它产品 13 问 这个抗体可用于免疫荧光吗 答 CST 科学家在很多情况下已经检测所有抗体用于免疫细胞化学 在有的情况下 用于免疫荧光 最终结果 在产品说明书和网站上 或者通过 tech cst 与技术支持交流以获得更多细节 14 问 CST 如何确保抗体的质量 答 CST 科学家努力检测所有产品的主要应用如免疫印迹 免疫沉淀 免疫细胞化学 免疫组化和 ELISA 我们也常规检测我们的抗体在不同物种上的应用 包括人 小鼠 大鼠 在 CST 产品的高质量是 我们最关心的 我们不断地检测产品的新应用 如果你对说明书上未列出的某个特定的应用感兴趣 请联系 CST 技术支持 tech cst 以获得最新应用的更新或者其它帮助 15 问 CST 如何对不同的批次进行质量控制 答 CST 科学家努力达到每批产品的一