僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究

1 / 8僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究作者：彭延古许光明赵建国彭新君曾序求【摘要】 ：目的 探索僵蚕水煎液、醇沉液和凝胶色谱馏分各部位中的抗凝活性成分。方法 用水煎煮、60%醇沉处理和凝胶色谱方法制备抗凝活性部位,用化学反应鉴别、氮测定法、电导、紫外吸收光谱和高效液相色谱方法检测各部位中的蛋白质或多肽和氨基酸类及草酸铵等成分。结果 僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分,其含量在 80%以上。醇沉处理使草酸铵含量下降约 52%,而多肽、氨基酸类含量仅降低约 8%。凝胶色谱净化后,多肽、氨基酸类含量与水煎部位比约提高 28%,与醇沉处理部位比约提高 39%,而草酸铵含量与醇沉液部位相当,但比水煎煮部位降低约 1 倍。各部位的固形物中,15 种氨基酸含量在40%50%,占定氮法测定的蛋白质含量的 60%76%；多肽类成分的分子量为 kDa。结论 本研究为僵蚕抗凝活性成分的进一步分离纯化提供了实验基础。 【关键词】 僵蚕抗凝活性部位化学成分凝胶色谱法高效液相色谱法氮测定法Abstract：Objective To explore the anticoagulating active components in water 2 / 8extraction, alcohol sedimentation and fraction separated by gelfiltration chromatography of Bombyx Batryticatus. Methods Anticoagulating active fractions were prepared by the methods of water extraction, 70% alcohol sedimentation and gelfiltration chromatography. Components (such as porteins or polypeptide, amino acids, oxalic acid ammonium) in each fraction were determined by chemical reaction indentification, Kjeldahl method, conductance, UV and HPLC. Results Polypeptide, amino acids and oxalic acid ammonium were the main components in anticoagulating active fractions, content of which reached more than 80%. The content of oxalic acid ammonium decreased about 52% processed by alcohol sedimentation, while the content of polypeptide and amino acids only decreased about 8%. The content of peptides and amino acids increased about 28% purified by gelfiltration chromatography compared with the one in water extraction and about 39% compared with the one in alcohol sedimentation. The content of oxalic acid ammonium was the same as the one in alcohol 3 / 8sedimentation, but decreased about 1 time compared with the one in water extraction. The content of 15 kinds of amino acids were 40%50% in the solids of each fractions, which maked up to 60%76% of the content of proteins determined by Kjeldahl method. Molecular weight range of peptides is kDa. Conclusion This study provides a experimental basis for further separation and purification of anticoagulating active components from Bombyx Batryticatus.Key words：Bombyx Batryticatus；anticoagulating active fractions；chemical components；gelfiltration chromatography；HPLC；Kjeldahl method僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕 Bombyx mori 5 龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体,为传统中药,性味咸、辛、平,归肝、肺、胃经1。具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效,可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分2-4,其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用5-7,草酸铵和蛋白质(或4 / 8多肽)、氨基酸等可能为其主要活性成分8。为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分,本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析,现报道如下。 1 实验材料Waters 515 HPLC 系统(Waters 公司)；BS100A 自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂)；Start-4 半自动四通道血凝仪(法国 STAGO 公司)；4300-Pro 紫外分光光度计(瑞士安玛西亚公司)；HR2838 型匀浆机(菲力普公司)；LP115 pH计(METTER TOLEDO 公司)；DDS-A 电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪( mL 和 mL,日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16 和 Z-26 层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech 公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司,批号 N25006)；兔血浆(自制)；15 种氨基酸对照品(Sigma 公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学试剂均为分析纯。2 方法与结果样品溶液的制备5 / 8称取制僵蚕 1 500 g(样品 A),用 8 倍量水浸泡过夜,以 3 000 r/min 匀浆,然后煎煮 2 次, 每次 30 min,过滤,合并滤液,离心,得提取液 8 450 mL(样品 B),将其浓缩至含原药材 2 g/mL,加无水乙醇浓度至 60%,4 放置过夜,3 000 r/min 离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约 6 g/mL,即得粗提液 240 mL(样品 C)。将 30 mL 该液加到用 mol/L NaCl的 mol/L Tris-HCl (pH )缓冲液平衡的 Sephadex G-25 凝胶柱( cm80 cm)上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集, mL/ (10 min管),每 23 管按文献方法8测定凝血酶时间(TT,s)、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度(m/v)、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线(见图 1)。将 TT 在 40100 s 之间的组分合并得洗脱液 69 mL(样品 D),TT100 s 的组分合并得洗脱液 mL(样品 E),E 即为抗凝活性部位。图 1 表明, 紫外吸收光谱法(UV)检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位,与 UV 法测得的 G-25 凝胶色谱峰值不重合,而按质量百分浓度(M/V)和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。抗凝活性部位的化学成分理化鉴别茚三酮反应、pH 值、电导率、AgNO3/HNO3 反应和6 / 8CaCl2/HNO3 反应 分别取 BE 样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的 BE 样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与 AgNO3 产生白色沉淀,滴加 HNO3 后沉淀部分溶解,与 CaCl2 产生沉淀,滴加 HNO3 沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。紫外吸收光谱取各样品稀释适当后在 200400 nm 扫描,其紫外吸收光谱见图 2。图 2 表明,样品 BE 的 UV 光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV 光谱变化较大。样品 E 的凝胶色谱分析及其分子量分析取样品 E 中 TT600 s 的馏分 2 mL 上 Sephadex G-15( cm50 cm)柱,用水洗脱盐, mL/(10 min管),自动分步收集器收集,测定各管的 TT 值、260 nm 和 280 nm 处的吸光度及化学反应特性,结果见表 1。表 1 TT600 s 馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检测结果注：*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在之间,计算而得7 / 8定量分析固形物含量测定精密吸取样品 BE 各 mL,80 下烘至近干,100 下烘至恒重,精密称定,按每 1 mL 样品溶液扣除 mg 的 Tris和 NaCl 重量,得固形物重量和浓度(各样品均为 n3,RSD不超过%),结果见表 2。表 2 僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果注：*与样品 A 比指标检测 蛋白质：按中华人民共和国药典中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。将该氮含量扣除铵态氮含量,再与相乘,即为蛋白质质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n3,RSD 不超过%。铵根9：按中华人民共和国药典中半微量氮测定法操作(40% NaOH 试液用 120 g/L 氧化镁悬浊液代替),计算铵根质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n3,RSD 不超过%。草酸根3：精密取 BE 样品液约 5 mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定(各样品均为 n3,RSD不超过%)。结果见表 3、表 4。表 3 僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果注：*与样品 B 比表 4 僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较HPLC 法测定氨基酸含量色谱条件8 / 8色谱柱：Agilent ODS( mm200 mm, 5 m)；流动相 A 为 50 mmol/L NaAc(pH )-甲醇-THF(82171),流动相 B 为 50 mmol/L NaAc(pH )-甲醇-THF(22771),梯度洗脱；柱温：27 ；流速： mL/min；荧光检测器：ex 338 nm,em 425 nm。样品测定 样品溶液 BE 经 mol/L 盐酸液,在 110 水解 24 h,OPA 试剂