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生物反应器的比拟放大 1 发酵放大是一门艺术 而不是一门科学 A E Humphrey 2 Contents 1 生物反应器比拟放大的概念2 生物反应器比拟放大的方法3 生物反应器比拟放大需要考虑的因素4 小结 3 生物反应器的放大是指在反应器的设计与操作上 将小型反应器的最优反应结果转移至工业规模反应器中重现的过程 生物工程产品的研究开发的三个阶段 1 实验室阶段 2 中试 3 工厂化生产 1 1比拟放大的定义 1 生物反应器比拟放大的概念 4 第一阶段实验室规模 进行菌种的筛选和培养基的研究 5 第二阶段中试工厂规模 确定菌种培养的最佳操作条件 6 第三阶段工厂大规模生产 7 表1小型和大型生物反应器设计的不同点 8 核心问题 生物反应器中有三种重要的过程 1 热力学过程 2 微观动力学过程 3 传递过程 而核心问题是传递过程 因为规模的放大对传递过程的影响最大 放大目的 维持中试所得到的最佳的细胞生长速率 产物的生成速率 产品的质量高 成本低 必须使菌体在大中小型反应器中所处的外界环境完全或基本一致 1 2放大的核心问题和目的 9 1 3比拟放大的准则 1 恒定单位体积功率由Pg V恒定而确定搅拌转速 Pg指通气时的搅拌功率 对黏度较高的非牛顿型流体或高细胞密度培养 应用Pg V恒定原则进行放大的效果十分良好 10 这个方法抓住了传氧这一关键因素 目前应用很多 具体应用中要注意几个问题 1 小试中要测得准确的kLa值 选择合适的计算公式 2 注意各计算kLa公式在放大中参数的变化及适用范围 3 按照计算P0 Pg选择通气比 计算V 从而计算kLa P0指不通气时的搅拌功率 2 恒定传氧系数 kLa 11 剪切力与搅拌桨叶端的线速度成正比 从断裂菌丝溢出核酸类物质的数量与叶尖的线速度相关 在恒定体积功率放大时一般维持nd不变 n为搅拌桨转速 d为搅拌桨直径 一般搅拌叶轮直径与罐直径之比为0 33 0 45 3 恒定剪切力恒定叶端速度 12 4 恒定混合时间 tM 混合时间 tM 把少许具有与搅拌反应器内的液体相同物性的液体注入搅拌反应器内 两者达到分子水平的均匀混合所需要的时间 低黏度液体在小搅拌反应器内的混合时间很短 反应器愈大 混合时间就愈长 实际上按等混合时间放大是很难做到的 因为要做到这一点 放大后反应器的搅拌桨转速需要比小反应器搅拌桨转速提高很多 但作为一个校对的指标 对某些体系确实必要 13 1 4比拟放大一般流程 生物反应器的比拟放大是为了到达预期经济目标 因此要综合考虑 抓住关键的因数 比拟放大的一般流程为 1 几何相似放大确定放大的尺寸 2 按公式计算放大的其它参数 3 根据具体情况进行适度调整 14 理论放大法建立反应系统的动量 质量和能量平衡方程 求解半理论放大法对难于求解的动量横算方程简化因次分析法将动量 质量 热量衡数以及有关的边界条件 初始条件以无因次形式写出用于放大过程 由于对事物的机理缺乏透彻的了解 难以建立精确模型 以kLa或Kd相等为基准放大经验放大以P0 VL相等为基准放大以搅拌叶尖线速度相等为基准放大以培养液溶氧浓度为基准放大 2 生物反应器比拟放大的方法 15 2 1理论放大方法 所谓理论放大法 就是建立及求解反应系统的动量 质量和能量平衡方程 由于发酵过程的复杂 有关反应的酶未全部明白 以及搅拌功率在传氧和剪切力之间较难平衡 所以这种放大方法是十分复杂的 很难在实际中应用 目前主要应用在最简单的系统 发酵液为静止或流动的滞留系统如某些固定化生物反应器的放大 但此方法是以最系统 最科学的理论为依据的方法 还是具有重要指导意义的 16 如对于常见的机械搅拌通气发酵罐 想要应用理论放大方法就必须了解 必须了解三维热传递方程 且边界条件十分复杂 传递过程之间必须是偶联的 即从动量衡算方程求解的流动分量必须用于质量和热量平衡方程的求解 动量衡算往往假定反应系统为均相液体 但对通气生物发酵 培养液中存在大量气泡较难分析 17 对于许多通气发酵生产 其产物相对浓度受单位体积发酵液搅拌功率或体积容氧系数的影响 不论细菌还是酵母其目的产物与P V或Kla关系右如图 通常反应器放大应选用曲线近乎水平的范围 18 局限性 总之 对于发酵反应器的理论放大 主要问题是目前仍无法求解生物反应系统中的动量衡算方程 所以 理论放大方法只能用于最简单的系统 例如发酵液是静止的或流动属于滞留的系统 如某些固定化生物反应器的放大 以便建立简单的动量 质量和能量平衡方程 19 2 2半理论放大方法 由上可知 理论放大方法难于求解动量衡算方程 为解决此矛盾 可对动量方程进行简化 对搅拌槽反应器或鼓泡塔 只考虑液流主体的流动 而忽略局部 如搅拌叶轮或罐壁附近 的复杂流动 20 简单液体在稳态条件下 质量衡算方程为 21 局限性 半理论放大方法是生物反应器设计与放大最普遍的实验研究方法 但是 液流主体模型通常只能在小型实验规模的发酵反应器 5 30L 中获得 并非是在大规模的生产系统中得到的真实结果 故使用此法进行放大有一定风险 必须通过实际发酵过程进行检验校正 22 2 3因次分析放大法 所谓因次分析放大法就是在放大过程中 维持生物发酵系统参数构成的无因次数群 称为准数 恒定不变 把反应系统的动量 质量 热量衡算以及有关的边界条件 初始条件以无因次形式构建方程用于放大过程 尽管因次分析放大法的应用有严格的限制 但此法还是十分有用的 对因次分析放大法 准数的合理构建是关键 生化过程常用参变量分为4大类 1 几何参数D H d 2 物理化学参数 3 过程变量N P V 4 气体常数g R 另外准数需要经验和直觉的结合 参数不能选太多若选用到了无关或影响甚微的参数 参数过多就无法放大了 若缺了重要参数 系统就无法用数学模型正确表达 故必须对系统进行分析 确定起主导作用的机理 忽略无关参数 这点很重要 23 生物反应器的因次分析放大过程 24 局限性 应用因次分析放大法进行反应器放大 从原理上讲 准数一经获得 进行生物反应器的放大就简单了 只要对小型实验室反应装置与大型生产系统的同一准数取相等数值就可以了 但实际上却并不那样简单 虽然均相系统的流动问题较易解决 但对于有传质和传热同时进行的系统或非均质流动系统 问题就复杂了 25 2 4经验放大法 除上面介绍的3种生物反应器的放大方法之外 还有经验放大法 这也是最常用的放大方法 根据不完全的调查结果 生物发酵工厂中好氧生物发酵反应器应用的各种经验方法的比例 如表3所示 26 表2通气发酵罐放大方法的比例 注 P0 发酵罐中不通气的搅拌功率 kw VL 发酵罐中反应溶液的体积 m3 kla 发酵罐中体积溶氧系数 1 s或1 h 27 经验放大法的分类 以kLa或Kd相等为基准放大以P0 VL相等为基准放大以搅拌叶尖线速度相等为基准放大以混合时间相等为基准放大 28 许多好氧发酵 特别是生物细胞浓度较高时耗氧很快 故溶氧速率是否能满足生物细胞的代谢与生长就成为生物发酵生产的限制因素 生物发酵的耗氧速率可通过实验测定 实践证明 高好氧发酵应用等kLa的原则进行反应器放大通常可获得良好结果 2 4 1以kLa为基准的比拟放大法 29 以kLa为基准的比拟放大法适用条件 高浓度细胞培养 消耗氧气的速度很快 氧气的传递速率成为发酵关键因素 30 在耗氧发酵过程中 培养液中的溶解度很低 生物反应很容易因反应器溶氧能力的限制受到影响 以反应器KLa的相同作为放大准则 可以收到较好的效果 以KLa值相同放大时 一定要选一个合适的KLa值 可根据微生物发酵产物的产率与KLa大小的关系 31 2 4 2以Po VL相等为准则的比拟放大 这种方法适用对于以溶氧速率控制发酵反应的生物发酵 粘度较高的非牛顿型流体或高细胞密度的培养P0 VL 常数1 对于不通气的搅拌反应器2 对于通气搅拌反应器 可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大 32 对于通气式机械搅拌生物反应器 可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大 即 对于通气式机械搅拌生物反应器 可取单位体积液体分配的通气搅拌功率相同的准则进行放大 对于不通气时的机械搅拌生物反应器 轴功率计算 33 2 4 3以搅拌叶尖线速度相等为基准放大 实践表明 应用丝状菌进行发酵 因这类微生物细胞受搅拌剪切的影响较明显 而搅拌叶尖线速度是决定搅拌剪切强度的关键 若仅仅维持kLa相等而不考虑搅拌剪切的影响 可能导致放大设计失误 在Po VL相等的条件下 Di D越小 即转速越高 搅拌剪切越强烈 这有利于菌丝团的分散和气泡的破裂细碎 从而有利于溶氧传质和胞内代谢产物的向外扩散 因此通常有利于代谢产物抑制发酵的生物反应系统 34 例如 在使用放线菌发酵生产新生霉素时 在维持Po VL不变的条件下 使用较小的搅拌叶轮可获得较高产量的抗生素 如图所示 35 总结 所以 对于此类发酵系统 搅拌叶轮尖端线速度也是发酵反应器放大设计的重要因素 可作为放大基准 但必须明确 若搅拌叶轮直径 Di D 过小 则搅拌泵送能力下降 混合时间加长 这会影响反应溶液混合的均匀性 通常 对大多数的生物发酵 搅拌叶尖线速度宜取2 5 5m s 对于球状或短杆状微生物可适当增大 但最高也不宜超过10m s 36 2 4 4以混合时间相等为基准放大 1 混合时间 发酵罐内放入某种指示剂使发酵液和指示剂达到分子水平均匀混合所需要的时间 2 对于不同反应器型式和反应介质 其混合时间有不同的关联式 进行设计和放大时应作出合理的选择 3 不适用于大型发酵罐 因为如果按此原则Di D 搅拌叶轮 会变大 即转速变小 这样溶氧效率低而且剪切力变大 但可作为一个标准进行校准 37 1 几何相似放大 按反应器的各个部件的几何尺寸比例进行放大 放大倍数实际上就是反应器的增加倍数 2 4 5其他放大方法 38 2 通风量的放大 按单位体积液体通风量Q V相等 大型反应器液柱高 空气在液体中所走的路程和气液接触时间均长于小型反应器 因此大型反应器的有较高的空气利用率 放大时大型反应器的Q V比小型设备的Q V小 按通风截面空气线速度Vs相等 放大反应器空截面的空气线速度Vs的大小表征了液体的通风强度 对于空气利用率较好的反应器 大罐的Vs应适当大于小罐的 按通风准数相等放大 按体积溶氧系数相等放大 39 3 搅拌功率放大 搅拌功率是影响溶氧最主要的因素 因而在机械搅拌生化反应器中 搅拌功率的放大是整个放大中最主要的内容 对于一定性质的液体 由于搅拌功率的大小取决于搅拌转速n和搅拌器直径Di 因此搅拌功率的放大实际上是n和Di的放大 若集合相似 则Di一定 放大问题就只是选择搅拌转速n的问题 40 表3放大方法的比较 按照上述不同放大准则所得出的结论 并以搅拌转速进行比较 41 总结 从表3可以看出 采用不同的放大准则 其结果相差很大 这表明 若仅考虑将某一参数作为放大准则进行放大 则有一定片面性 这是因为各个参数之间相互联系 而这种联系又不都是简单的比例关系 因此要求放大过程中要保证所有因素都不变是不可能的 对于经验放大法 根据统计 在实际放大过程中应用最多的是以kLa或P0 VL相等为基准的放大 42 3 生物反应器比拟放大需要考虑的因素 物理因素氧传质系数 KLa 单位体积的搅拌功率剪切应力化学因素过程因素种子的级数灭菌条件 43 3 1物理因素3 1 1氧传质系数 KLa KLa能用于表征氧的传质能力 KLa受罐的大小 搅拌器的挡数和形状 转速 挡板 通气速率 罐压等的影响 KLa在发酵过程中随发酵液黏度的改变而变化 特别是丝状菌的发酵 为非牛顿型流体特性 应在线过程监测 44 3 1 2单位体积的搅拌功率 单位体积的搅拌功率常被用于发酵过程的放大 此法的好处是容易从小型发酵罐中获得 一些重要的因素 如黏度 已包含在搅拌功率的实验数值内 如现成的电机功率不足 采用稀配方或减小发酵罐的装量也是一个方法 45 3 1 3剪切应力 在大型发酵罐中培养丝状菌 如真菌或放线菌 其菌丝常被搅拌叶打断 剪切应力与搅拌叶尖的线速度成正比 从断裂菌丝溢出核酸类物质的数量与叶尖的线速度相关 培养对剪切应力敏感的微生物 应降低搅拌速率 相应增加搅拌器的直径和采用多挡搅拌器 以提高发酵液的溶氧 46 圆盘弯叶 圆盘平直叶 圆盘箭叶 凹叶圆盘 圆盘平直叶具有很大的循环输送量和功率输出 适用于各种流体 在混合要求特别高 溶氧速率相对要求略低时 可用圆盘弯叶 圆盘箭叶轴向流动较强烈 输出功率较低 凹叶圆盘能耗低 缩短混合时间 47 3 2化学因素 主要包括培养基的组成 浓度 氧化还原电位 pH 气体CO2 O2等 在小型发酵罐中优化的培养基成分放大到生产罐中不一定合适 特别是影响产物合成的主要因素在生产过程中需要监测 并通过补料控制在适当的水平 48 研究表明 通过通气和搅拌控制氧化还原电位 从10L放大到100L和1000L中试罐 甚至是几何形状不同的搅拌罐 是最为成功的方法 不过 此法对其他品种的发酵是否适用还有待证实 49 3 3过程因素 随着发酵罐的容量增大 所需种子罐的级数增加 且各级的种子培养基也不同 需满足生产菌不同生长阶段的需求 原材料的批与批之间的质量差异有时也会影响产量 实地 罐内 或连续 罐外 灭菌的方法对培养基的破坏是不同的 其结果也会影响产物的合成 50 3 3 1种子的级数 随着过程的放大 各级种子的质量也很重要 可以遵循以下的原则 种子接种到生产罐后 其停滞 适应 期应尽可能缩短 应有足够量的种子 细胞的生长形态适合 51 3 3 2灭菌条件 对实罐灭菌来说 大型发酵罐所需的灭菌时间要长很多 这样常