多聚酶链式反应(PCR).ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片段 教材内容 基础知识 一 PCR原理 二 PCR的反应过程实验操作操作提示结果分析与评价课题延伸练习 一 课题目标 本课题通过尝试PCR DNA多聚酶链式反应 技术的基本操作 使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法 理解PCR的原理 讨论PCR的应用 教材分析 二 课题重点与难点 课题重点 PCR的原理和PCR的基本操作 课题难点 PCR的原理 教材分析 三 课题背景分析 课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术 然后说明这一技术在遗传疾病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆等方面都有着广泛的应用 最后指出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理 并尝试用PCR技术扩增DNA片段 教师在导入本课题的学习时 可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用 以激发学生的学习兴趣 然后再说明本课题的目标 教材分析 四 基础知识分析与教学建议 一 PCR原理知识要点 1 细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件 2 DNA的合成方向 3 TaqDNA聚合酶的应用 教材分析 一 PCR原理教学建议 理解PCR的原理 需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件 教师在教学过程中 可以首先引导学生回忆必修2 遗传与进化 中的有关DNA复制的知识 在此基础上 学生需要进一步了解DNA双链的方向 能够区分DNA的3 端和5 端 此外 学生还需要了解DNA聚合酶的特性 如只能从DNA的3 端开始延伸DNA链 而不能从头合成DNA等 教学建议 一 PCR原理教学建议 TaqDNA聚合酶的应用 解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题 促成了PCR技术的自动化 是一个重要的知识点 教师可以结合专题2中课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 Taq细菌的发现过程 帮助学生加深理解 教学建议 二 PCR的反应过程 知识要点 PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化 教材分析 二 PCR的反应过程教学建议 这部分内容的教学应以读图识图为主 教科书中图5 9 PCR反应过程图解 详细地描绘了参与PCR的各组成成分 每一轮反应的三个基本步骤 变性 复性和延伸 每一轮中每一个步骤所发生的变化 即每个步骤所具有的作用 教师在教学中可以请学生在读图的同时 结合教科书中的文字说明来加深理解 当学生遇到难以理解的地方时 教师要及时给予解答 教学建议 一 PCR原理 体内DNA复制 模板DNA原料 dNTP酶 解旋酶 DNApol 起始引物 合成方向合成环境 解链 模板变性引物 起始 引物 模板复性子链延伸 子链延伸 一 PCR原理 加样器的使用 结果分析与评价 此为紫外光吸收检测的结果检验法 实践中很少用 普遍采用琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果 Fig 7 23 DenatureAnnealPCRPrimersExtendPCRPrimersw TaqRepeat 多聚酶链式反应 PCR 扩增DNA片段 一 实验目的 了解PCR的基本原理 学习PCR的基本操作技术 二 实验原理 多聚酶链式反应 PolymeraseChainReaction 简称PCR 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法 典型的PCR由高温变性 低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期 通过多次循环反应 使目的DNA得以迅速扩增 其原理如下 将待扩增的DNA置于高温下使之解链 人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合 DNA聚合酶在72 将单核苷酸从引物的3 端开始掺入 沿模板5 3 端方向延伸 合成DNA的新互补链 反复进行这种变性 退火和延伸反应循环 可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增 循环的次数主要取决于模板的浓度 从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106 PCR的基本原理 变性 复性 半保留复制 一生二 二生四 四生万物 PCR三步曲 变性90 97 退火45 65 延伸72 左右 PCR过程 二 PCR的反应过程 变性 复性 延伸多重循环 n 模板以2En扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度在P1 P2之间 PCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域 它既可用于基因的分离 克隆和核苷酸序列分析 又可用于突变体和重组体的构建 基因表达调控和研究 基因多态性的分析 遗传病和传染病的诊断 肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面 也被广泛运用于刑侦物证鉴定 亲子鉴定及古分子系统学研究等其他领域 三 实验材料 器材及试剂 待扩增的模板DNA DNA热循环仪 电泳仪 电泳槽 台式离心机 紫外检测仪 1 5ml离心管架 移液器 1 5ml离心管 0 2ml离心管 枪头等 dNTPs Taq酶 引物一对 10 PCRReactionBuffer TdH2O PCR反应体系的五要素 引物 酶 dNTP 模板和Mg2 TaqDNA聚合酶来自水生栖热菌Thermusaquaticus良好的耐热性Mg2 依赖性无校读功能 1 PCR反应 PCR反应混合液的配制 n为反应数 n 2 0 l反应缓冲液 即10 PCR反应缓冲液其中含15mMMgCl2 n 2 0 ldNTP 2mM each n 1 5 l引物F 2 M n 1 5 l引物R 2 M n 0 1 lTaq酶 5U l 混匀 取19 l分别加入n个0 2mlPCR管中 各管加入模板DNA1 l 轻轻用手摔一下 无菌薄壁管中顺序加入反应体系各成分 双 三蒸水 l10 缓冲液2 5 l25mmol LMg2 2 5 l4 dNTP2 0 l50umol L引物12 0 l50umol L引物22 0 l模板DNA1 2 lTaqDNA多聚酶1 0 l25 0 l轻弹管壁 使各成分充分混匀 实验操作 1 PCR反应体系 四 实验步骤 实验操作 2 设定循环程序 阶一 94 3m阶二 94 30s 55 1m 72 1m 25 35循环阶三 72 5 10mPCR反应在带热盖的PCR仪上进行 大约需要两个半小时 操作提示 1 一切器具均经高压灭菌 烘干 冷却后使用 2 各试剂小份分装 20 保存 现用现取 3 酶的取用不离开冰浴 取液吸头 离心管均一次性使用 及时更换 2 PCR产物的检测 制备1 0 的琼脂糖凝胶 取5 lPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 紫外检测仪下观察 记录结果 电泳结果有无目标条带出现 可判别 结果 根据条带宽度和亮度 可直观判断扩增产量 关于PCR假阴性 假阳性及非特异扩增问题 电泳检验PCR结果 分析与评价 PCR扩增NGF基因 大鼠 ratbeta nervegrowthfactorsequence5 301gttctacactctgatcacagcgtttttgatcggcgtacaggcagaaccgtacacagagat361caatgtcccagagggagactctgtccctgaagaccactggactaaacttcagcattccct421ctgacacagccctacgcagagcccgcagtgcccctgctgaaccaatagctgcccgtgtgac481agggacgacccgcaacatcactgtggaccccaaactgtttaagaaacggagactccgttc541accccgcgtgctgtttagcacccagcctcccaaactgtttaagaaacggagactccgttc 3 Perim1 5 gatcggcgtacaggcagaac 3 328 347Perim2 3 cgcggggtgaacggagtctc 5 529 548预期扩增长度 220bp DNAMarker NGF 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 220bp PCR引物设计 一对引物 分别与靶DNA5 和3 端互补长度 15 30个核苷酸引物内 引物间不应有互补序列引物与非特异扩增区无同源性引物的设计可以参照 两分钟StepByStep学会引物设计软件Primerpremier5 0 oligo软件核酸基因技术讨论版 生物信息学讨论版 PCR技术讨论版 引物设计 1 长度在15 30bp GC含量在45 55 之间 Tm 4 G C 2 A T 2 碱基分布表现出随机性 避免相同碱基连续排列 3 3 不能与引物内部互补 以免形成二级结构 4 两个引物各自的3 不能互补 以免形成自身扩增 5 引物必须经GenBank查询后 证实没有与其他非目的DNA高度互补 才能使用 PCR的反应特点 特异性强灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的 能将pg 10 12级的起始待测模板扩增到微克 g 10 6 水平简便 快速 PCR反应一般在2 4小时完成扩增反应对标本的纯度要求低 DNA粗制品可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液 体液 毛发 细胞 活组织等扩增检测 五 注意事项 使用的全部溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染 所有PCR试剂中使用的水都应该是最高质量的三蒸水 所有试剂都