利用TRIzol_试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总RNA

利用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA txt 我羡慕内些老人羡慕他们手牵 手一直走到最后 交话费的时候 才发现自己的话那么值钱 第 30 卷第 5 期 西安交通大学学报 医学版 Vol 30 No 5 2009 年 10 月 Journal of Xipan Jiaotong University Medical Sciences Oct 2009 利用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA 李冬民 1 2 任吴超 1 2 王 璇 1 2 王飞苗 1 2 高 玉 1 2 韩 燕 1 2 宁启兰 1 2 宋天保 1 3 吕社民 1 2 西安交通大学医学院 1 环境与疾病相关基因教育部重点实验室 2 遗传学与分子生物学系 3 人体解剖学与组织胚胎学系 陕西西安 710061 摘要 目的 建立胰腺高质量总 RNA 快速 经济 稳定的提取方法 方法 应用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺总 RNA 通过总 RNA 含量和 A260 280 比值的测定及 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳评估总 RNA 的质量 并用 RT2PCR 检 测大鼠胰岛素 1 胰高血糖素 胰 2 淀粉酶和 2actin 的表达 结果 利用 TRIzol 和液氮提取的大鼠胰腺总 RNA 量 可达到 3 6 g mg 胰腺组织 A260 280 比值在 1 75 1 89 之间 在 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳时 均可见 28S 及 18S 条带 并且在 28S 18S 条带间可见明显的云雾状阴影 大鼠胰岛素 1 胰高血糖素 胰 2 淀粉酶 2actin RT2PCR 产物电泳结果显示均有清晰的条带 结论 应用 TRIzol 试剂和液氮成功地提取了大鼠胰腺高质量的总 RNA 后者 可用于 RT2PCR 研究 关键词 大鼠胰腺 总 RNA 提取 TRIzol 试剂 液氮 中图分类号 Q813 文献标志码 A 文章编号 167128259 2009 0520639204 REN Wu2chao1 2 WAN G Xuan1 2 WAN G Fei2miao1 2 HAN Yan1 2 NINGQi2lan1 2 SON G Tian2bao1 3 1 Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases Ministry of Education of China A method with TRIzol reagent and liquid nitrogen to extract high2quality RNA from rat pancreas LI Dong2min1 2 GAO Yu1 2 L B She2min1 2 Medical School of Xipan Jiaotong University Xipan 710061 2 Department of Genetics and Molecular Biology Medical School of Xipan Jiaotong University Xipan710061 3 Departmentof HumanAnatomy Histology and Embryology Medical School of Xipan Jiaotong University Xipan 710061 China ABSTRACT Objective To establish a quick economical and reproducible method for high2quality RNA extraction from pancreas Methods We utilized TRIzol Reagent and liquid nitrogen to isolate total RNA from the rat pancreas The RNA quality was determined by detection of its content and optic density A at 260 280 nm and electrophoresis in 1 non2denatured agarose gel Then reverse transcription2polymerase chain reaction RT2 PCR was performed to detect expression of the pancreas2specific genes Results The content of the total RNA extracted from the rat pancreas reached 3 6 g mg pancreatic tissues and A260 280 ratio was 1 75 1 89 Electrophoresis of the total RNA showed 28S and 18S rRNA bands with clear smear between them The RT2PCR products of pancreas2specific genes including insulin 1 glucagon 2amylase and housekeeping gene 2actin all exhibited clear bands on 1 agarose gel which were located in the expected positions respectively Conclusion These results suggest that we have successfully isolated the high2quality and intact RNA from the rat pancreas with TRIzol Reagent and liquid nitrogen The extracted total RNA can be used in RT2PCR for pancreatic gene expres2 sion KEY WORDS rat pancreas total RNA extraction TRIzol reagent liquid nitrogen 收稿日期 2008212223 修回日期 2009203218 基金项目 国家自然科学基金资助项目 No 30400249 30571725 30630058 陕西省国际科技合作重点项目 No 20072KW206 陕西省自然科学 基金资助项目 No 2004C256 陕西省卫生厅基金资助课题 No D204028 SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina No 30400249 30571725 30630058 theInternationalCooperational Foundation of Shaanxi Province No 20072KW206 the Natural Science Foundation of Shaanxi Province No 2004C256 and the Foundation of Health Department of Shaanxi Province No D204028 通讯作者 宋天保 教授 博士生导师 E2mail songtbao 吕社民 教授 博士生导师 E2mail lushemin mail xjtu edu cn 作者简介 李冬民 19702 女 汉族 博士 研究方向 2 型糖尿病等代谢性疾病的分子发病机制 6 40 西安交通大学学报 医学版 第 30 卷 1968 年 COX 用盐酸胍代替酚作为蛋白质变性 剂 建立了分离纯化 RNA 的方法 1979 年 CHIR2 GWIN 成功地利用异硫氰酸胍裂解 并以氯化铯为 基质经超高速离心从富含核糖核酸酶的组织中 分离 到未降解的 RNA 并成为当时提取 RNA 的主要方 法 1987 年 CHOMCZYNS KI 和 SACCH I 在联合 应用异硫氰酸胍和酚提取 RNA 的基础上 建立了用 酸性异硫氰酸胍 2 酚 2 氯仿抽提一步法分离 RNA 的方 法 由于省略了以氯化铯为基质经超高速离心这一步 骤 分离 RNA 的时间缩短为 4h 不但使 RNA 的产 量和纯度大大提高 而且还可从微量的细胞和组织中 提取 RNA 这种提取 RNA 的方法被广泛应用 并 且被商业化 尽管目前已能成功地从原核生物 真核 生物的多种组织和细胞中提取 RNA 但由于胰腺易 自溶和富含内源性核糖核酸酶 1 导致很难获得高质 量的胰腺 RNA 给研究胰腺组织的基因表达带来很 表 1 大鼠胰腺中表达的 4 个基因的引物序列和扩增片段大小 大困难 我们经过反复试验 利用 TRIzol 试剂和液 氮从大鼠胰腺组织中成功提取完整的 RNA 可用于 RT2PCR Northern blotting 差异显示 抑制性消减 杂交及芯片等的研究 1 材料与方法 1 1 实验动物 SPF 级 E3 雌性大鼠 4 只 体重 220 250 g 由西安交通大学医学院实验动物中心提供 1 2 主要试剂及仪器 TRIzol 试剂 Invitrogen 公 司 反转录试剂盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis Fermentas 公司 T aq DNA polymerase Ta KaRa 公司 蛋白核酸定量仪 CE2321 GENEGUEST 凝胶成像系统 SYNGENE PCR 热循环仪 P TC2200 BIO2RAD 用 PrimerPrimier 5 0 设计 PCR 引物 并由上海桑尼生物科技有限公 司合成 引物序列见表 1 2AGCAAGCA GGTCATTGTTCC23 2T T GCGGGTCCTCCACTTC23 2ACCGT TTACA TCGT GGCT23 Sense primer 5 Antisense primer 5 Sense primer 5 Antisense primer 5 Tab 1 The primer sequence and size of PCR products of the 4 genes expressed in the rat pancreas Gene Primer sequence Size of PCR products Sense primer 5 Insulin 1 209 bp Antisense primer 5 Glucagon 492 bp 2GTCTCT GGT GGCAA GGT TA T23 2ACA T T GGT GTA GCA GGGT T23 2amylase 318 bp 2CAAGGGCTCTGTCA GTAGG23 Sense primer 5 2CACCC GCGA G TACAA CCTTC23 2actin 207 bp Antisense primer 5 2CCCA TACCCACCA TCACACC23 1 3 大鼠胰腺的取材和保存 取材所用的器械 180 干烤 6 h 不能干烤的塑料制品用 1 mL L DEPC 水 37 处理过夜 高压烤干后备用 戊巴比妥钠麻 醉 E3 大鼠 快速取胰腺尾部组织约 20 30 mg 装 入 DEPC 处理过的冻存管中 液氮中保存或液氮速 冻后 80 保存备用 1 4 利用 TRIzol 和液氮提取大鼠胰腺总 RNA 将胰腺组织从液氮或 80 低温冰箱中取出 立即 放入装有适量液氮的研钵中迅速研磨成粉末 研磨过 程中始终保持研钵内有液氮 然后 将胰腺组织粉末 移入 1 5 mL 的 EP 管中 加入 1 mL TRIzol 剧烈 震荡 30 s 并在室温放置 5 min 加入 0 2 mL 氯仿 剧烈振荡 15 s 室温放置 3 min 4 12 000 g 离心 15 min 样品分为 3 层 上层无色水相 下层粉红色有 机相 中间白膜层 将上清转移至另一新的 D EPC 处理过的 1 5 mL EP 管中 此步绝对不能吸入中间 白膜层 加入 0 5 mL 异丙醇 混匀后 20 放置 30 min 4 12 000 g 离心 10 min 弃去上清 用 750 mL L 乙醇洗涤 RNA 胶样沉淀 4 7500 g 离心 5 min 室温放置 10 15 min 干燥 加入 60 L D EPC 水溶解 RNA 沉淀后 280 保存 若长期保 存 RNA 也可用无 RNA 酶的去离子甲酰胺溶解 1 5 大鼠胰腺总 RNA 定量及 A260 280 比值鉴定 用 99 L DEPC 水稀释总 RNA 1 L 后 用核酸 蛋白质 微量定量仪检测大鼠胰腺总 RNA 的含量及 A260 280 比值 1 6 10 g L 非变性的琼脂糖凝胶电泳检测大鼠胰 腺总 RNA 电泳 RNA 所用器械如制胶的模具 梳 子 电泳槽等用 30 mL L 过氧化氢溶液浸泡 30 min 用 DEPC 水冲洗 3 遍 室温晾干备用 用对 RNA 酶 有抑制作用的 D EPC 水配置电泳缓冲液 TA E 及其 他所有溶液 用新的 0 5 TA E 配制 10 g L 琼脂糖 凝胶 溴化乙锭 EB 直接加入凝胶中 点样时 样品 RNA 每 2 5 L 加入 0 5 L6 上样缓冲液 以 5 V cm 电压电泳 30 min 左右取出凝胶 在凝胶成像 系统观察所提取的 RNA 并拍照记录 1 7 RT2PCR 法检测胰岛素 1 胰高血糖素 胰 2 淀 粉酶和 2actin 的表达 按照 RevertaidTM First 5 期李冬民 任吴超 王 璇 等 利用 TRIzol 试剂和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明 反转录合成 cDNA 第一链 逆转录反应体系总体积 20 L 含胰 腺总 RNA 5 g M2MUL V 逆转录酶 200 u L 1 L cDNA 合成后保存在 80 冰箱中备用 PCR 扩增大鼠胰岛素 1 胰高血糖素 胰 2 淀粉 酶和 2actin 取高压灭菌的 0 2 mL 的 PCR 小管 4 支 分别依次加入 10 PCR Buffer 2 5 L dN TP Mixture 各 2 5 mmoL L 2 L T aq DNA poly2 merase 5 u L 0 125 L 上下游引物各 1 L cD2 NA 0 5 L 灭菌蒸馏水 17 875 L 反应总体积 25 L 混匀后 短暂离心 反应条件 94 5 min 94 1 min 60 3 1 min 72 1 min 延伸 共 32 个循环 最后 72 10 min 产物鉴定 取 20 L PCR 扩增产物在 10 g L 琼脂糖凝胶上电泳鉴定 用凝胶 成像系统进行分析 2 结 果 2 1 大鼠胰腺总 RNA 定量 A260 280 比值及 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳结果 利用 TRIzol 试剂和 液氮提取的 4 只 E3 大鼠胰腺总 RNA 量可达到 3 6 g mg 胰腺组织 A260 280 比值在 1 75 1 89 之间 在 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳时 均可见 28S 及 18S 条带 28S 与 18S 条带灰度比值大于 1 8 并且在 28S 和 18S 条带间可见明显的云雾状阴影 图 1 RNA 的提取是分子生物学中最常用的操作技术 之一 由于 mRNA 分子容易受到核糖核酸酶的破坏 而降解 加上核糖核酸酶广泛存在且极为稳定 因此 图 1 利用 TRIzol 试剂和液氮提取的大鼠胰腺总 RNA 的 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳 Fig 1 10 g L non2denatured agarose gel electrophoresis of the total RNA isolated from pancreas of 4 E3 rats 1 4 with TRIzol reagent and liquid nitrogen 2 2 RT2PCR 法检测大鼠胰腺特异性基因的表达 RT2PCR 产物的 10 g L 琼脂糖凝胶电泳结果显示 大 鼠胰腺特异性表达基因胰岛素 1 209 bp 胰高血糖素 492 bp 和胰 2 淀粉酶 318 bp 以及管家基因 2actin 207 bp 均有清晰的条带 未见非特异性扩增 图 2 图 2 大鼠胰腺特异性表达基因 RT2PCR 产物的 10 g L 琼脂糖凝胶电泳 Fig 2 RT2PCR analysis of products of pancreas2specific genes from rat pancreas on 10 mL L agarose gel M DNA marker 1 insulin 1 2 glucagon 3 amylase 4 beta2 actin 3 讨 论 抑制核糖核酸酶的活性成为 RNA 提取过程中的关 键问题 常规的组织和细胞 RNA 的提取要求所有 与 RNA 接触的仪器和装置都要严格处理 以尽量减 少外源性 RNA 酶污染造成的 mRNA 降解 2 然而 对于易于自溶和富含内源性 RNA 酶的胰腺组织的 RNA 提取 常规方法因不能完全抑制 RNA 酶活性 而使胰腺 RNA 的提取失败 目前 仅有少量文献报 道胰腺组织的 RNA 提取方法 主要有两种 原位 胰腺导管灌注 RNA 酶抑制剂 然后提取 RNA 3 将新鲜胰腺组织样品保存于 RNAlater2ICE 中 用液 氮或干冰速冻后 提取 RNA 425 第一种方法由于胰 腺导管灌注成功与否是提取胰腺完整 RNA 关键 因 而要求有很高的导管穿刺技术 穿刺失败 则前功尽 弃 因而重复性差 第二种方法也是目前研究中主要 用的方法 但由于所用试剂较多 步骤繁琐 也不容易 在众多实验室推广 商业所售的 TRIzol 试剂提取总 RNA 实质上 是酸性异硫氰酸胍 2 酚 2 氯仿抽提一步法分离 RNA 6 按照 TRIzol 试剂操作步骤通过匀浆可非 常容易地提取多种组织的 RNA 如果直接用匀浆法 破碎富含核糖核酸酶的胰腺组织 由于胰腺组织中的 细胞不容易迅速与裂解液 TRIzol 试剂充分接触 RNA 酶不能迅速被灭活而致提取的 RNA 降解 因 此 在抑制 RNA 酶活性的同时 使组织充分的裂解 6 42 西安交通大学学报 医学版 第 30 卷 降解问题也就迎刃而解 RNA 酶活性在低温环境 液氮 干冰 或 RNA 酶抑制剂中可被完全抑制 728 与干冰和 RNA 酶抑制剂相比 液氮具有更经济 易 于获得的优点 在研究中 我们利用 TRIzol 试剂和液氮经过 50 余次的实践 最终成功提取了大鼠胰腺高质量的 总 RNA 总 RNA 定量 A260 280 比值测定和 10 g L 非变性琼脂糖凝胶电泳结果均提示 所提取的大鼠胰 腺总 RNA 没有降解 完整性很好 为了进一步鉴定 所提取的 mRNA 的质量及其是否可以用于下游实 验 如 RT2PCR Northern blotting 差异显示 抑制 性消减杂交 芯片等的研究 我们选用 RT2PCR 检测 了大鼠胰腺特异性基因的表达 结果显示 不但管家 基因 2actin 条带清晰 而且胰腺内分泌部特异性表 达基因胰岛素和胰高血糖素以及外分泌部特异性表 达基因胰 2 淀粉酶 在 marker 所指示的位置均有清 晰的条带 没有非特异性扩增条带 在设计引物时 我们特别注意选择位于不同外显子上的上下游引物 从而保证了 R T2PCR 模板来源于 mRNA 反转录后 的 cDNA 而非 DNA 利用 TRIzol 和液氮提取大鼠胰腺高质量总 RNA 的方法 不但经济 简单方便 而且重复性好 但在具体操作中有几点要特别注意 取胰腺组织的 动作一定要快 胰腺组织在 80 保存前一定要 用液氮速冻 研磨过程中要及时添加液氮 保证胰 腺组织在研磨时一直浸在液氮中 防止 mRNA 降解 反转录时也要避免外源性 RNA 酶的污染 J J Vir ol Met hods 2001 94 12 1292135 7 WA N G SS S H ERMAN M E RA D ER J S et al Cervical tissue collection met hods f or RNA p reservation comp arison of s nap2 f r oze n et ha nol2fixed a nd RNAlat er2fixation J Diagn Mol Pat hol 2006 15 3 1442148 参考文献 1 POTENZAN SALVATOREV MIGLIOZZIA etal Hybrid2 ase activity of human ribonuclease21 revealed by a real2time flu2 orometricassay J Nucleic Acids Res 2006 34 10 29062 2913 2 张传仓 刘卫鹏 朱德新 等 富含 RNA 酶组织的总 RNA 提取方 法的改良 J 世界华人消化杂志 2005 13 6 7972799 3 MULLIN AE SOUKATCHEVA G VERCHERE CB et al Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high2quality RNA from mouse pancreas J Biotechniques 2006 40 5 6172621 4 MUTTERGL ZAHRIEHD LIUC etal Comparisonoffro2 zen and RNA later solid tissue storage methods for use in RNA expression microarrays J BMC Genomics 2004 5 1 88 5 KIBA T KINTAKA Y NAKADA E et al High2quality RNA extraction from rat pancreas for microarray analysis J Pancre2 as 2007 35 1 982100 6 XIANG X QIU D HEGELE RD et al Comparison of differ2 ent methods of total RNA extraction for viral detection in sputum 8 DEKAIRELLEAF VAN DER VORSTS TOMBAL B et al Preservation of RNA for functional analysis of separated alleles in yeast comparison of snap2frozen and RNALater solid tissue storage methods J Clin Chem Lab Med 2007 45 10 12832 1287 编辑 卓选鹏 上接第 615 页 参考文献 1 CAS TEL O2BRANCO C GARCIA2FANTINI M HAVAJ Vas2 cular reactivity and atheromatous plaques in postmenopausal women on tibolone treatment Open prospective study with Doppler ultrasonography in internal carotid artery J Maturi2 tas 2005 50 4 2592265 2 BOTS ML EVANS GW RILEY W et al The effect of tibolone and continuous combined conjugated equine oestrogens plus me2 droxyprogesterone acetate on progression of carotid intima2media thickness the osteoporosis prevention and arterial effects of tiboLone OPAL study J Eur HeartJ 2006 2